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2 - PLAGUICIDAS

DEFINICIÓN:

Según la OMS, un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carácter orgánico o inorgánico, que está destinada a combatir insectos, ácaros, roedores y otras especies indeseables de plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, producción de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, también aquellos que pueden administrarse a los animales para combatir insectos arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos.

CLASIFICACION: Según la especie a combatir

El término plaguicida incluye también los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta, agentes para evitar la caída prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha, para proteger el producto contra el deterioro, durante el almacenamiento y transporte.

Desde el punto de vista de la toxicología, es importante señalar que las formulaciones de plaguicidas además del principio activo incluyen sustancias transportadoras, diluyentes como agua o solventes orgánicos, aditivos e impurezas, que pueden tener potencial tóxico por si mismas.

El análisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas áreas:
-Forense
-Diagnóstico de urgencia
-Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
-Contaminación ambiental.

Si el plaguicida fue causa de muerte, estará en alta concentración, al igual que en una intoxicación aguda grave. En las dos últimas áreas se trabaja con muestras con niveles muy bajos de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de “residuos” de plaguicidas. De todos ellos estudiaremos los insecticidas organoclorados, organofosforados y carbamatos, por ser los más utilizados actualmente y producir efectos tóxicos muy característicos.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

Estas propiedades son las determinantes de su cinética ambiental. El aire, el agua, el suelo y los alimentos retienen gran parte de los pesticidas y éstos llegarán a los seres vivos.
Constituye un problema actual su persistencia en el medio ambiente, su concentración y transformación en organismos vivos.

ETIOLOGIA

Las intoxicaciones accidentales son generalmente de origen profesional, afectando al los obreros que trabajan en la preparación de los insecticidas o a los peones rurales durante o inmediatamente después de la aplicación en cultivos.

Las intoxicaciones alimentarias se deben al consumo de alimentos tratados impropiamente con pesticidas. Las intoxicaciones casuales se deben generalmente a confusiones, manejo imprudente y falta de vigilancia de los niños.

Las intoxicaciones suicidas y criminales se han hecho más frecuentes debido a su alta toxicidad y fácil adquisición.

PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS

Desde el punto de vista estructural, constituyen un grupo de sustancias, muy heterogéneo, teniendo en común la presencia de estructuras monocíclicas o policíclicas con distinto número de sustituyentes cloro.

Incluyen varios grupos:
a) Grupo de los Ciclodienos:Aldrín y su epóxido, el Dieldrín, Mirex
b) Grupo del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano): p-p´-DDT, o-p´-DDT, p-p´-Metoxiclor.
c) Grupo del Hexaclorociclohexano (HCH) y Hexaclorobenceno(HCB): HCH, -HCH, HCB.
d) Grupo de los indenos clorados: hepatacloro, a-Clordano.
e) Grupo de los terpenos clorados: Toxafeno.

Absorción

Por vía digestiva principalmente; a través de la piel cuando están en solventes lipídicos y a través de la vía respiratoria por su aplicación en forma de pulverizaciones.

Mecanismo de acción

Poseen acción neurotropa, aunque no se conoce bien el mecanismo sobre el sistema nervioso. A largo plazo, inducen las enzimas microsomales hepáticas. Son inductores en cantidades residuales, del orden de las que pueden estar acumuladas en el tejido adiposo.

En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y se pudo determinar que tienen una gran afinidad por los tejidos grasos. Estas cantidades acumuladas en grasas preocupan, pues por ejemplo, en el caso de adelgazamiento brusco pasan a la circulación general y producen síntomas de intoxicación.
Preocupa también, porque pasan en cantidades considerables a la grasa de la leche. Los recién nacidos se pueden ir contaminando, debido a los residuos de pesticida presentes en su alimento natural.

Muestras

La sangre es la muestra más adecuada para la búsqueda de plaguicidas organoclorados ya que por su gran liposolubilidad rara vez aparecen en orina. Se colectan 8-10 ml de sangre en tubo de centrífuga heparinizado.

Jugo gástrico: evitar el agregado de carbón vegetal . Conservar en la heladera.

Distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos cárneos y aguas. Los alimentos son considerados como la principal vía de acceso de los pesticidas organoclorados al organismo (80-90% del ingreso diario de plaguicidas según Kaphalia, 1985).

PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS

Son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo, pero con gran actividad neurotóxica que va a producir intoxicaciones agudas de gravedad. Son los insecticidas, junto con los carbamatos y piretroides, más ampliamente utilizados en la actualidad.

Sus estructuras químicas derivan de la sustitución por restos orgánicos en el fósforo pentavalente. Pueden clasificarse como:

a) Derivados de la molécula del ácido fosfórico. Si los dos primeros oxhidrilos se esterifican con radicales alquílicos se obtienen los alquil-fosfatos o alquil-pirofosfatos (ejemplo: dichlorvos) . Si dichos oxhidrilos se sustituyen por amidas se obtienen las fosforamidas (ejemplos: metamidofós, acefato).

b) Derivados de la molécula del ácido fosforotiónico: De este ácido derivarán a su vez numerosos ésteres tiofosfóricos (ejemplo: paratión).

c) Derivados del ácido fosforotiolotiónico. (ejemplo: malatión).

d) Derivados del ácido fosforotiólico (ejemplos: malaoxón, demeton-S-metil.).

Mecanismo de acción

Los insecticidas organofosforados actúan combinándose con gran afinidad con cierto tipo de esterasas, con la consecuencia de su inactivación. Esta reacción, en el contexto de la fisiología de sus funciones, es irrevesible. Los oxofosforados (enlces P=O) son fuertemente inhibidores, mientras que los tiofosforados (P=S) no son fuertemente inhibidores y necesitarán de una biotransformación a la forma oxo para actuar como inhibidores.

En particular, la inhibición de las colinesterasas es la que va a derivar en los síntomas y signos de la intoxicación aguda. El papel fisiológico de la colinesterasa consiste en la hidrólisis de la acetilcolina, mediador químico en la transmisión del impulso nervioso. Se acumulan así grandes cantidades de acetilcolina en las sinapsis.

Existen dos tipos de colinesterasas: la colinesterasa verdadera, presente en eritrocitos y tejido nervioso y la pseudocolinesterasa presente en suero o plasma.

Ambas enzimas son inhibidas por los compuestos organofosforados, pero la eritrocitaria es la que mejor refleja el estado de inhibición de la colinesterasa del sistema nervioso, por lo que se utiliza para evaluar el estado de intoxicación aguda de un paciente. Por otro lado, la colinesterasa plasmática o pseudocolinesterasa es la que más tarda en regenerarse, por lo que se utiliza en la evaluación de la exposición crónica a organofosforados.

Absorción:

Los ésteres fosforados se absorben fácilmente a través de la piel y más rápidamente por vía digestiva. La absorción respiratoria es casi instantánea.

Muestras

La muestra mas utilizada para la determinación de organofosforados y sus metabolitos es orina de 24 hs, colectada en envase de vidrio y conservada en heladera.
También, como índice de la intoxicación, puede determinarse la actividad de las colinesterasas sanguíneas: plamática o eritrocitaria.
La determinación de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos cárneos y aguas de bebida, y por otro lado en muestras ambientales como aguas superficiales y suelos.

CARBAMATOS

Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas. Todos ellos derivan del ácido carbámico:

Se los divide en tres grupos:

1-N-metil carbamatos: uno de los hidrógenos del grupo amino es reemplazado por un grupo metilo (ejemplos: Aldicarb, Carbaryl, Carbofuran).

2-N,N, dimetil Carbamato: ambos hidrógenos del grupo amino son reemplazados por grupos metilos (ejemplos: Isolan, Pirolan).

3-N-fenil Carbamatos: un grupo fenilo sustituye a uno de los hidrógenos del grupo amino.

Mecanismo de acción

Es equivalente al mecanismo de acción de los organofosforados, uniéndose a las colinesterasas e inactivándolas. Pero ésta unión es reversible espontáneamente en menos de una hora, de manera que en el curso de una intoxicación aguda por carbamatos se manifiestan los mismos signos y síntomas de la intoxicación por organofosforados pero con un curso más rápido hacia la recuperación.

Muestras

Se los encuentra en orina de 24 hs. También se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados, principalmente de origen vegetal.

INVESTIGACION DE PLAGUICIDAS

CONSIDERACIONES GENERALES

Los plaguicidas deben aislarse de los materiales en los que se encuentran para su investigación. Los extractos deben someterse a una purificación antes de investigarlos y/o determinarlos cuantitativamente. La identificación se realiza por CGL o TLC. La CGL permite alcanzar más bajos límites de detección , sobre todo con detectores específicos para cada clase de pesticida (OC, OP ).

Se distinguen tres pasos fundamentales en su determinación:

1- EXTRACCION del plaguicida de la matriz originaria y traspaso a una fase separable. La mayoría de los plaguicidas se extraen de las muestras con solventes como el éter de petróleo, acetonitrilo o acetona; o bien cloroformo o éter etílico en medio neutro o ácido dependiendo del plaguicida y del tipo de muestra.
MUESTRAS que pueden llegar al laboratorio:
-Biológica: lavado gástrico, sangre, orina , vísceras.
-No biológica: preparados (polvos, emulsiones, etc.), alimentos, agua, aire, suelo.

2- PURIFICACION del plaguicida (eliminación de otras sustancias interferentes).Los métodos de purificación no son generales para los distintos plaguicidas y algunos no lo son, siquiera para todos los plaguicidas de una misma familia. En general, los extractos pueden purificarse por partición con solventes y/ o por cromatografía en columna de florisil, celite, sílica gel, alúmina o carbón activado.

3- DETERMINACION Cualitativa y/o Cuantitativa (TLC y CGL). La identidad de un plaguicida debe confirmarse por un segundo método. Por ejemplo, si el plaguicida se ha reconocido por CGL podrá efectuarse un TLC; una CGL empleando un detector selectivo para otro elemento presente en el plaguicida; o bien una CGL con columnas recubiertas con fase(s) de polaridad diferente a las usadas en el primer análisis; o una CGL combinada con un espectrómetro de masas.

Para el dosaje de plaguicidas se requieren métodos que los separen y detecten cuantitativamente, siendo el más adecuado la CGL.

A- Investigación de plaguicidas en frutas y verduras

1- EXTRACCIÓN: tomar 50 gramos del vegetal elegido y se colocan en un homogeneizador (licuadora) junto con 100 ml de acetonitrilo y 5 gramos de celite, homogeneizar durante 2 minutos a gran velocidad. Filtrar por succión con papel de filtro poro medio y medir el volumen obtenido: V1

Transferir la mitad de V1 a una ampolla de decantación de 500 ml, agregar 20 ml de éter de petróleo (EP); agitar durante 1 o 2 minutos, luego agregar 10 ml de sol. concentrada de ClNa y 100 ml de agua destilada.

Agitar vigorosamente durante 30-45 segundos. Retirar la fase acuosa. Lavar la fase EP con 20 ml de agua destilada dos veces. Filtrar la fase EP por papel de poro medio que contenga sulfato de sodio anhidro y medir el volumen obtenido: V2.

Concentrar en plancha calefactora o en Baño de María (con mucho cuidado hasta 2 o 3 ml finales).En el residuo se identifican OC y OP por TLC y/ o CG (en el residuo purificado).

2-PURIFICACIÓN: (Fase Estacionaria por Vía Húmeda): tomar entre 3 y 5 gramos de florisil activado a 650ºC, 5 Hs. y luego mantenido a 130ºC . Suspender en éter de petróleo. Agregar esa suspensión a la columna cromatográfica poco a poco, de manera que se forme una lluvia fina de Florisil, homogeneizando con golpes cuidadosos, hasta obtener una altura de 10 cm. Sobre el Florisil y operando de manera similar, añadir sulfato de sodio anhidro llegando a una altura total de 12 cm.

Dejar eluir el EP hasta que sólo sobrepase la fase estacionaria Florisil-sulfato de sodio en 2-3 mm. y sembrar la muestra. Dejar eluir hasta unos pocos mm por encima del sulfato de sodio y comenzar con el agregado del eluyente elegido (al principio, el agregado se efectúa con pipeta , para no romper la fase estacionaria y luego se llena el reservorio). Se eluye a una velocidad de flujo de 5mm/ min o menor, con tres fracciones de solvente de elución de 100 ml cada una.

El primer solvente de elución es éter etílico al 6% en éter de petróleo, el segundo es éter etílico al 15% en éter de petróleo, y el tercero es éter etílico al 50% en éter de petróleo.

Los plaguicidas se van eluyendo de acuerdo a la relación de polaridades de estos dos solventes:

Fracción del 6%:

Clorados: Aldrin, DDE, DDT, Heptacloro

Fosforados: Ethión

Fracción del 15%:

Clorados: Dieldrin, Endrin

Fosforados: Metilparatión, Diazinón, Paratión

Fracción del 50%:

Fosforados: Malatión

Concentrar cada fracción hasta no más de 2-3 ml. Este será utilizado para sembrar en TLC o inyectar en un cromatógrafo gaseoso.

B-Investigación de plaguicidas en orina, sangre y lavado gastrico

1-EXTRACCION:

Se utilizan las columnas tipo EXTRELUT , rellenas con tierra silícea como soporte inerte.

Si la muestra a sembrar consiste en ORINA, se acidificarán 19 ml de la misma con 1 ml de solución saturada de ACIDO TARTARICO (pH: 5-6).

Si la muestra es PLASMA o SUERO se realiza una dilución con agua destilada (4 ml de suero o plasma se llevan a 19,5 ml con agua destilada) y se acidifica con 0,5 ml de solución saturada de ácido tartárico.

Si la muestra es LAVADO GASTRICO, se toman 9,5 del mismo y se llevan a 19 ml con agua destilada (si no se practica la dilución , el líquido taponaría la columna por su alta densidad) y se acidifica con 1 ml de solución saturada de ácido tartárico.

Se realiza una primera elución con éter de petróleo (E1). Se cambia el recipiente de recolección y se eluye ahora con éter etílico obteniéndose un segundo extracto (E2). Ambos extractos se concentran por evaporación a Baño María.

En el primer extracto (E1), se aislarán los plaguicidas ORGANOCLORADOS. Para sembrarlo en TLC es necesario resuspender con Hexano.

En el segundo extracto (E2) se hallarán los ORGANOFOSFORADOS y CARBAMATOS. Para sembrarlo en TLC, es necesario resuspender en una mezcla Tolueno: Propanol (1: 1).

C- Investigación de plaguicidas en aguas

Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantación de 1 litro. Se agrega 25 ml de n-hexano. Se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se separan las fases y se recoge la capa de n-hexano. Se efectúan 2 extracciones más con n-hexano y se reúnen los extractos. Secar la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja temperatura.

Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, por eso se parte de un gran volumen de muestra.

D- Investigación de plaguicidas en visceras. Método de Fassi adaptado.

1-EXTRACCION:

En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vísceras, bien trituradas, se le agrega ácido tartárico sólido (como desproteinizante) hasta pH ácido y luego sulfato de sodio anhidro mezclando hasta consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una corriente de aire caliente (secador de cabello).

El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material se extrae con éter de petróleo (punto de ebullición 40-60ºC ) agregándolo hasta cubrir la papilla. Agitar enérgicamente durante 60 segundos, repitiéndose el proceso dos veces más. Dejar en reposo hasta una neta separación de las fases. Reservar la fracción etérea para la investigación de plaguicidas.

2-PURIFICACION:

El extracto de éter de petróleo se trata con acetonitrilo saturado en éter de petróleo; se dispersa en agua (200 ml de agua destilada con 10 ml de solución saturada de ClNa); se extrae con 50 ml de éter de petróleo.
Si el extracto está impuro se toma con Celite 545 , mezclando cuidadosamente y eliminando el solvente en corriente de aire, hasta que no queden partículas aglomeradas.

Se prepara una columna (de 0,8 x 16 cm) taponándola con algodón y colocando en ella la muestra absorbida en el Celite a través de un embudo y compactando el polvo tanto como sea posible con una varilla.

Se prepara una segunda columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenándola con éter de petróleo, empujando con una varilla de vidrio un tapón de algodón hasta el fondo. Posteriormente se agregan 5 g de alúmina y luego 5 g de Florisil , cubriendo finalmente con una capa de arena de 2 a 2,5 cm de espesor, drenándose el solvente , hasta que el nivel del mismo alcance la parte inferior de la capa de arena.
Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la columna de 1,4 cm. La columna pequeña que contiene los plaguicidas se eluye con 3-4 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) aplicando presión positiva.
Abriendo la llave de la columna grande se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirándose luego la columna superior y comenzando la elución con 100 ml de éter de petróleo. Recoger el eluído en un vaso de precipitado y evaporar suavemente.

DETERMINACION cuali / cuantitativa de OC, OP y CARBAMATOS.

a)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOCLORADOS POR TLC

Se usa esta metodología cuando se sospecha una alta concentración de plaguicida en la muestra. Sembrar la muestra (el extracto etéreo purificado) y patrones en una placa de sílica G (9 gramos de sílica G: 18 ml de agua).

Fase Fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.
Fase Móvil: n Hexano:Acetona (9:1)
Testigos: DDT, Gamexane

Desarrollar hasta llegar el frente de solvente a 10 cm.

Revelado: Difenilamina al 0.2% en etanol absoluto.
Rociar y exponer a UV entre 20 -60 minutos. Determinar los Rf característicos de las muestras y patrones. Se detectan concentraciones del orden de los microgramos.

b)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOFOSFORADOS POR TLC

Fase fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.
Fase Móvil: n Hexano:Acetona (8:2)
Testigos: Paratión, Malatión

Revelado 1: Cloruro de paladio al 0.5% en HCl al 10%
Rociar y calentar a 80º C durante 20 minutos. Aparecen manchas pardas para fosforados. Determinar los Rf y caracterizar las manchas halladas en función de los patrones.

Revelado 2: Inhibidor de la Colinesterasa. Una vez corrida la placa , se la expone a vapores de bromo dentro de una cuba. El bromo oxidará el azufre de la molécula de OP a oxígeno.

En hígado también ocurre una oxidación del plaguicida por oxidasas microsomales hepáticas, aumentando su potencial tóxico.

Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en el resto de la reacción , se hace una aspersión con la enzima Colinesterasa y se lleva a estufa a 37ºC durante 30 minutos. La enzima se obtiene a partir de un homogenato de hígado (lugar donde se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o plasma fresco.

Luego de hacer la aspersión , la enzima será inhibida en los sitios donde se encuentra el plaguicida. Para evidenciarlo se pulveriza con acetato de alfa naftilo/ Fast Blue. El acetato de alfa naftilo es sustrato de la enzima y liberará naftol. Luego el naftol se copula con el Fast Blue dando color lila donde la enzima es activa.

Donde la enzima es inhibida por el plaguicida no se produce la reacción , quedando blanco. La placa se verá lila con manchas blancas.
Sensibilidad: 0,1 a 1 ng.

Interferencias: fenotiazinas, cocaína dan positiva la reacción. Cuando da negativa se puede descartar la presencia de OP; si da positiva debe confirmarse con otros revelados.

c)-IDENTIFICACION SIMULTANEA DE OP, OC Y CARBAMATOS POT TLC

Fase fija: sílica gel G activada.
Fase Móvil: Ciclohexano:Hexano:Cloroformo:Acetona (4:4:1:1).

Testigos:

OCl: Heptacloro y Lindane

OF : Parathion y Malathion

Carbamatos: Furadan y Carbaryl.

Revelado: se lleva a cabo un revelado secuencial que consiste en:

1-Difenilamina alcohólica. Rociar y colocar la placa al sol durante 30 minutos. Los pesticidas organoclorados aprecerán de color gris verdoso.

2-KOH al 10% en agua. Calentar suavemente.

3-Tetrafluorborato de nitrobencenodiazonio en etanol con gotas de etilenglicol o propilenglicol. Los carbamatos aparecen azules o rosas.

4-Cloruro de Paladio 0,5% en HCl al 10%. Los organofosforados aparecen de color naranja.

d)-IDENTIFICACIÓN de OC y OP en CGL

En la cromatografía gas- líquida la muestra se distribuye entre dos fases: una fija y una móvil. A través de la fase fija (líquida), adsorbida sobre un soporte inerte, circula la fase móvil (gas) transportando la muestra vaporizada.

Las moléculas de la muestra tardarán cierto tiempo en recorrer la columna según su polaridad con respecto a la fase fija.

Cuando circula el gas portador, se registrará una línea de base. Cuando se inyecta la muestra y se detecta, aparecerá un pico.

Del cromatograma se obtendrá la siguiente información:

-Tiempo de retención: es el tiempo que tarda en aparecer el pico, desde la inyección hasta la altura máxima del mismo.

-Área del pico: es proporcional a la concentración de la muestra.

Para identificar una sustancia se debe pasar la muestra por distintas columnas, de diferente polaridad. Si en todas coincide el tiempo de retención de la muestra con el testigo, decimos que se trata de esa sustancia.

El flujo a través de la columna debe ser constante y es necesario regularlo de modo que permita el intercambio y se reproduzca el tiempo de retención.

La cámara inyectora se encuentra a elevada temperatura, en ella se siembra la muestra, la cual es vaporizada y arrastrada por el gas carrier.

Ventajas: alta resolución y gran sensibilidad. Detecta trazas.

Desventajas: es necesario la purificación previa de la muestra, para poder inyectarla. Además la muestra debe ser de bajo punto de ebullición para que se volatilice.

Conviene usar detectores que respondan a un número limitado de elementos o estructuras de modo de separar más eficazmente el plaguicida contaminante de las interferencias presentes en la muestra.

Para determinar OC se utiliza detector de captura de electrones. A medida que el gas portador (Nitrógeno) fluye a través del detector, una lámina de Ni radiactivo ioniza las moléculas del gas y genera electrones. Estos se desplazan hacia el ánodo lo cual produce una corriente de fondo que se visualiza como la línea de base en el cromatograma. Si se inyecta una muestra con moléculas que tengan átomos electronegativos , disminuye la señal eléctrica y en el cromatograma se ve un pico. Se detectan microgramos y hasta nanogramos de OC.

Generalmente se utiliza una columna capilar de polaridad intermedia con polifenil metil siloxano como relleno. Temperatura del detector: 300ºC. Gas portador: Nitrógeno (caudal: 10 ml/ min.). Programa de temperatura: Temperatura inicial de 190ºC durante 1 minuto. Temperatura final de 250ºC durante 6 minutos. La variación de temperatura es de 1º/ min. entre ambas.
Para los OP se utiliza un detector fotométrico de llama. Este detector consiste en una pequeña llama de hidrógeno quemándose en un exceso de aire y rodeada por un campo electrostático. El efluente de la columna (con Nitrógeno como gas portador) entra a la base del mechero y se mezcla con el Hidrógeno.
Los compuestos orgánicos al salir de la columna se ionizan y los electrones libres son colectados en un electrodo cargado positivamente aumentando de esta manera la corriente que circula por él, la cual es amplificada y registrada. Este detector responde sólo a átomos de Carbono que sean oxidables. Posee una sensibilidad del orden de los nanogramos. Para la determinación se inyecta entre 0.5-2 microlitros de muestra.

INHIBICION de COLINESTERASA - (Como recurso de identificación de la intoxicación con plaguicidas organofosforados y carbamatos ).

Debido a que resulta difícil encontrar algún plaguicida organofosforado en suero u orina o sus metabolitos, se recurre a determinaciones en suero, plasma o sangre entera que son muy rápidas y pueden dar indicio de la gravedad de la intoxicación.
Para la identificación rápida de colinesterasa, existen técnicas de ejecución simple, basadas algunas de ellas, en el empleo de papeles reactivos. El denominado Merckotest, se recomienda para determinar la actividad de la enzima en suero o plasma, no sólo es útil en casos de exposición o de intoxicación con inhibidores de colinesterasa, sino tambien en diversos estados patológicos (lesiones hepáticas) o para evaluar la acción de ciertos medicamentos sobre el sistema enzimático.

Método pHmétrico de Michel (para acetilcolinesterasa eritrocitaria).

FUNDAMENTO: La acetilcolinesterasa provoca la hidrólisis de la acetilcolina en colina y ácido acético. Este método estima la actividad de la enzima, midiendo el cambio de pH a través del empleo de un electrodo de vidrio.
Otros métodos como el de W. Caraway, registra el cambio de pH usando un indicador colorimétrico.

MUESTRA: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de sangre, obtenida por venopunción (evitar la hemólisis), transferirla a un tubo heparinizado (con una gota de heparina), tapar y agitar cuidadosamente por inversión.
Es conveniente separar el plasma de las células lo más pronto posible, cuando esto no se pueda llevar a cabo, se debe refrigerar la muestra a 4ºC durante 2-3 horas (no es conveniente por más tiempo).

Procedimiento para la determinación de acetilcolinesterasa eritrocitaria

Transferir 0.04 ml exactos de glóbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo 2 ml de saponina al 0.01 %, enjuagando la pipeta con la mezcla de saponina y glóbulos rojos, hasta que todas las células se desprendan de la pipeta.

Mezclar mediante vortex. Una vez preparadas las muestras, añadir a cada tubo 2 ml de solución tampón (para eritrocitos), esperar l0 min.

Determinar el pH de la solución hasta 0.01 de unidad y anotarlo como pH1, (si la lectura es< de 7.97 desechar la prueba y comenzar otro ensayo con una solución tampón recién preparada).

Añadir 0.4 ml de sol. 0.1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar con vortex y anotar como T1 el momento en que se añadió el yoduro , dejar reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, cumplido este tiempo determinar el pH de la mezcla, se tomará como pH2 y el momento que se mide como T2

CALCULO: El pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:

	(pH1 - pH2 -b) x ƒ
pH/hora=
	t reccion

b: corrección para la hidrólisis no enzimática (ver tabla)
ƒ: corrección para la variación de pH/hora con el pH.
t _reccion : T2-T1, expresado en horas.
Los factores de corrección para la hidrólisis no enzimática, no son lineales con respecto al tiempo.

Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de individuos normales de acuerdo a Michel, es de Delta de pH/hora: 0.75 para GR.

Factores de corrección que se emplean en el cálculo:

Procedimiento para la determinación de colinesterasa plasmática

La Colinesterasa sérica o plasmática (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa) cataliza la reacción de hidrólisis de los ésteres de la colina, tal como la S-butirilcolina, con máxima actividad a pH 7,7. La tiocolina liberada reacciona con el ácido 5,5’-ditiobis-2- nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto amarillo de acuerdo al siguiente esquema de reacción.

Butirilcolina + agua

Colinesterasa

Tiocolina + Butirato

Tiocolina + DNTB

2-nitro-5-mercaptobenzoato.

La velocidad de aparición de color es directamente proporcional a la actividad enzimática y se mide a 405 nm.

Criterios para determinación del grado y tipo de intoxicación.

Colinesterasa Sérica	Colinesterasa Eritrocitaria	Indica
Normal o poco descendida	>o.75 pH/h normal o poco descendida (0.75-0.60)	-No intoxicación. -Leve intox. -Intoxicación a carbamatos.
	discretamente descendida (0.60-0.50)	-Intoxicación moderada o a dosis repetidas
Muy descendida	muy descendida (0.50-0.25)	-Intoxicación grave (aguda).

CUESTIONARIO GUIA

1. Qué es un Plaguicida ?. Qué plaguicidas producen intoxicaciones en forma frecuente ?

2. Cuáles son las diferencias más importantes entre pesticidas Organoclorados y Organofosforados en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas ?

3. Respecto a los plaguicidas ORGANOCLORADOS indique su etiología, metabolismo y mecanismo de acción.

4. ¿Qué características clínicas orientan a la sospecha de intoxicación por un organoclorado?. ¿Cómo lo confirma en el laboratorio ?

5. Respecto a los plaguicidas OC indique su etiología, metabolismo, mecanismo de acción.

6. Respecto a los plaguicidas OP indique su etiología, metabolismo, mecanismo de acción. Idem para CARBAMATOS

7. ¿Qué características clínicas orientan a la sospecha de intoxicación por un organofosforado? Cómo lo confirma en el laboratorio ?

8. ¿Qué tipo de pesticida esperaría encontrar en una muestra de sangre de un paciente presuntamente intoxicado con pesticidas ? y en una muestra de orina ?

9. Respecto a los trabajos entregados, detalle claramente objetivos, metodología, resultado y conclusiones de los mismos.

10. ¿Cuáles son los pasos fundamentales en la investigación de plaguicidas?

11. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en frutas y verduras?

12. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en líquidos biológicos?

13. ¿Qué metodología emplea en la búsqueda de pesticidas en vísceras?

14. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de utilizar TLC y CG para OC y OP ?

15. La medida de la actividad enzimática de las Colinesterasas sérica y eritrocitaria es importante en el diagnóstico y tratamiento de la intoxicación por OP: ¿qué muestra utiliza en cada caso ? ¿Cuál de las dos determinaciones es la más importante y por qué?

16. ¿Cuál es el fundamento del método de Michael para la determinación de la actividad enzimática de la Acetilcolinesterasa?

17. ¿Cuál es el fundamento del método para la determinación de colinesterasa sérica?