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4 - ALCALOIDES


Los alcaloides son compuestos nitrogenados, que se comportan como bases frente a los ácidos, formando sales.

En su gran mayoría son de origen natural, sobre todo del reino vegetal, aunque se encuentren algunos semisintéticos y otros exclusivamente sintéticos.

Presentan notables propiedades fisiológicas y toxicológicas, que se ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno de sus niveles.

Por estas razones pueden ser usados como fármacos. El uso prolongado de alguno de estos de estos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que constituyen verdaderas toxicomanías, con dependencia física y psíquica y un aumento de la tolerancia.

Propiedades fisicoquímicas

Son sustancias que presentan en su constitución N, generalmente formando parte de heterociclos.
De acuerdo a su estructura pueden agruparse en distintos grupos químicos.

Bases acíclicas
Aminas aromáticas
Aminoalcoholes
Bases pirrólicas
Bases pirídicas
Derivados de glioxalina
Derivados del grupo tropano
Derivados indólicos
Bases quinoleicas
Bases isoquinoleicas
alcaloides fenantrenicos
derivados del ácido lisérgico
derivados de la tropolona
derivados de la aconina
Derivados de purina cafeína,
colina, muscarina
efedrina, mescalina
Veratrina, solanina
nicotina, higrina
coniina, lobelina
pilocarpina
cocaína, atropina, hiosciamina
eserina, estricnina,toxiferinas
Quinina
papaverina,narcotina, hidrastina
morfina, tebaína, codeína
ergotamina, ergobasina
colchicina
aconitina
teobromina

La presencia de oxígeno en la estructura determina que la sustancia sea un sólido blanco, de sabor amargo y cristalizables. La ausencia de oxígeno en la estructura del alcaloide hace que éste sea aceitoso, volátil u odorante.

La mayoría de los alcaloides son insolubles o muy poco solubles en agua, pero se disuelven bién en alcohol, éter, cloroformo u otros solventes orgánicos.

Se combinan con ácidos para dar sales, comportándose entonces como bases. Las sales son bastante solubles en agua e insolubles en solventes orgánicos.


En la diferencia de solubilidades de la base alcaloidea y de sus sales en agua y en solventes orgánicos se basa el método general de extracción.

Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada. Presentan una fluorescencia característica bajo al luz UV o IR, dando lugar a espectros característicos.

Aislamiento y caracterización.

Para la investigación de tóxicos alcaloidicos en materiales biológicos se requiere de extracción desde una determinada muestra, una posterior purificación y la aplicación de metodologías de identificación.

Dentro de estas últimas se consideran reacciones generales para alcaloides, reacciones de caracterización de alcaloides y técnicas de identificación y cuantificación mediante CG y HPLC.

Extracción.

El objetivo de la extracción es el aislamiento de los tóxicos de la muestra problema. que puede ser sangre, vísceras, orina, lavado gástrico, vómitos o, eventualmente, restos de alimentos y bebidas, preparados farmacéuticos.

Si la muestra constituye un material sólido se procederá con el método de extracción continua. En caso de ser una muestra líquida se tiene el método clásico de extracción en ampolla.

Método de extracción continua.

Es aplicable a material sólido o semisólido. Permite efectuar una extracción cuantitativa y reduce el tiempo de operación requerido por las técnicas clásicas.

Unos 25 gramos del material se desmenuza y se procura obtener una papilla homogénea, agregando 1 a 2 gramos de ácido tartárico. La papilla obtenida se mezcla en una proporción 1:2 con sulfato de sodio anhidro obteniendo una masa homogénea que se deja secar al aire en un lugar templado y a una temperatura menor a 50oC.

El material obtenido se disgrega y se deposita en un cartucho de papel de filtro para depositar en extractor Soxhlet.

El extracto se recoge en balón o erlenmeyer esmerilado con éter a reflujo. Se agregan unos 5 mililitros de amoníaco para producir la hidrólisis y liberar así los tóxicos extraíbles en medio alcalino.

Eliminación de proteínas.

En los métodos de extracción directa, por ejemplo a trabajar con sangre, la presencia de proteínas facilita la formación de emulsiones entre el agua y los solventes de extracción, que dificultan la separación de los alcaloides.

Por esta razón se procede a obtener filtrados libres de proteínas, para lo cual hay varios métodos. El más simple y directo consiste en el tratamiento con ácido clorhídrico concentrado y el calentamiento a bañomaría durante una hora a 90OC. Todas las sustancias unidas a proteínas son liberadas pero el tratamiento es muy enérgico y no es adecuado para sustancias termolábiles como cocaína, aconitina, atropina. Si se sospecha presencia de ellas, se intentará con ácido clorhídrico 1N y calentamiento hasta 40OC que no lo resisten. También se dispone de otras técnicas menos enérgicas.

Según el método de Stas-Otto, se procede a formar tartratos y oxalatos de alcaloides solubles en agua. La técnica es laboriosa pero da buenos resultados.

El método del ácido túngstico aprovecha la formación de precipitados insolubles entre éste y las proteínas.

La precipitación con sulfato de amonio es un muy buen método para drogas muy metabolizadas y extrae bién estricnina y morfina.

Se han probado métodos que involucran el tratamiento con proteasas, como papaína, tripsina y subtilisina-A, que muestran ventajas sobre los métodos tradicionales, por ser menos enérgicos y presentar altos porcentajes de recuperación.

Técnica de Stas Otto.

Una porción de papilla de la muestra se trata con dos volúmenes de etanol acidificando con ácido tartárico, dejando en maceración una noche.

Si se sospecha que no están presentes alcaloides lábiles en la muestra, se mantiene la mezcla a 60/70ºC durante al maceración.

A continuación se filtra y se procede a la evaporación del etanol, obteniéndose un residuo siruposo. Se trata nuevamente con un volumen de etanol absoluto tibio, se filtra y se evapora, obteniéndose un residuo granular seco. Finalmente se trata con una porción de ácido sulfúrico al 5%, obteniéndose un filtrado acuoso libre de proteínas.

Técnica del ácido túngstico.

Una porción de la papilla obtenida de la muestra, se trata con una parte de tungstato de sodio al 25%, dos partes de agua y una parte de sulfato ácido de sodio al 50%, calentando la mezcla a 60/70ºC.

Luego de obtener una preparación homogénea, se filtra por buchner, obteniéndose un extracto libre de proteínas.

Precipitación por sulfato de amonio.

Una porción de la papilla se trata con una parte de ácido clorhídrico diluido, y una parte de solución saturada de sulfato de amonio. La mezcla ase calienta y luego de enfriar ser procede a la filtración.

Extracción en ampolla.

Es aplicable a material líquido o en general, toda sustancia líquida o posible de ser solubilizada fácilmente.

Se agrega bicarbonato de sodio hasta reacción alcalina al papel tornasol. Se procede a la extracción con ampolla de decantación con tres porciones de 15 mililitros de éter etílico. Se obtienen dos fases, una acuosa y otra orgánica.

La fase acuosa se alcaliniza con hidróxido de amonio y se procede a la extracción con tres porciones de cloroformo. La fase orgánica obtenida luego de reunir los tres extractos , se filtra sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora hasta sequedad. Se resuspende con unos mililitros de etanol, constituyendo éste el extracto cloroformo alcalino.

La fase orgánica original, la de la primera extracción, se filtra sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora hasta casi sequedad, constituyendo éste el extracto éter alcalino.

En el extracto éter alcalino se encontrarán la mayoría de los alcaloides, mientras que en el extracto cloroformo alcalino se encontrarán a la morfina, estricnina, brucina y atropina.

Purificación.

Consiste en los procedimientos que tienen como finalidad la eliminación de impurezas que puedan enmascarar resultados.

Los extractos cloroformo alcalino y éter alcalino se evaporan a sequedad y ser tratan con una porción de ácido sulfúrico diluido a 1/5 v/v, se lava luego con tres porciones de 10 mililitros cada una de solvente, se trata luego con una porción de hidróxido de amonio hasta reacción alcalina, realizándose nuevamente una extracción con tres porciones de 10 mililitros de solvente. El extracto se evapora a sequedad. Las extracciones del extracto éter alcalino se realizan con éter etílico y las del extracto cloroformo alcalino se harán con cloroformo.

El residuo obtenido se redisuelve en etanol absoluto, obteniéndose una muestra adecuada para los análisis de identificación.

Identificación.

Los alcaloides, junto a otras drogas básicas de interés toxicológico, tienen un comportamiento análogo frente a un grupo de reactivos de precipitación que permiten sospechar su presencia. en una pericia toxicológica se hace uso de estas reacciones como primer paso de identificación, y a que una reacción positiva excluye la presencia de estos tóxicos, aunque una reacción positiva no asegura su presencia.

La reacción con el Reactivo de Mayer (tetraiodo mercuriato de potasio) da lugar a la formación de un precipitado amarillento amorfo o cristalino.

El Reactivo de Draggendorf (yodo bismutato de potasio) forma precipitados de dolor rojo anaranjado y en general amorfos.

El Reactivo de Bouchardat (triioduro) genera precipitados de color rojo pardo.

El procedimiento para estos reactivos generales comienza con la evaporación de 2 a 3 gotas del extracto etanólico en vidrio de reloj. Se agregan luego 2 a 3 gotas de ácido clorhídrico 5% hasta solubilizar los residuos. A esta solución se agrega una gota del reactivo correspondiente.

Caracterización.

La caracterización del alcaloide presente en la muestra problema permite descartar a un conjunto de sustancias alcaloideas y aproximarnos con relativa precisión a la identidad del alcaloide en cuestión. Dependiendo del objetivo del análisis que se efectúa, en función de los resultados de las pruebas de caracterización, se procederá a la aplicación de una técnica de confirmación.

La caracterización puede llevarse a cabo por diversas técnicas cromatográficas (en columna, en papel, en placa delgada, en fase gaseosa), espectrofotométricas (U.V., I.R.), por ensayos biológicos o por reacciones químicas.

Marcha sistemática de Banford.

Constituye una técnica tradicional para la identificación de alcaloides. Las reacciones químicas que la componen tienen valor relativo y sus resultados no deben tomarse como concluyentes.
Además la presencia de impurezas puede inhibir o alterar los resultados.

Marcha de Bandford

Grupo I Tebaina Rojo sangre a anaranjado
H2SO4 (c) Narcotina Amarillo limon
Grupo II Morfeolicos (morfina, apomorfina, codeina) violeta de tonalidad variable
Reactivo de Marquis Sinteticos (diluadid, dionina, heroina) violeta de tonalidad variable
Reaccion de Oliver Morfina, heroina rojo brillante
Fe3Cl 1% Morfina azul
  Heroina no desarrolla color
Grupo III
HNO3 fumante Brucina rojo intenso
  Eserina rojo anaranjado
Ensayo de Vitali Atropina, hiosciamina, escopolamina violeta azulado
Grupo IV
H2SO4 + Cr2O7K2 Estricnina azul violaceo a rojo violaceo
  Yohimbina estrias azules , violetas y verdes
  Curare rojo a violeta
Reactivo de Fröhde Estricnina no da color
  Yohimbina azul
  Curare marron
Reactivo de Mecke Estricnina no da color
  Yohimbina azul verdoso
  Curare marrón
Reactivo de Mandelin Estricnina azul violáceo
  Yohimbina azul brillante
  Curare violeta
Grupo V
Reactivo alcohól-ácido    
  Novocaína amarillo (en frío)
  Nicotina, mezcalina rosado violáceo (en caliente)
Grupo VI
Cl2 y vapores de NH3
Cafeína rojo, con vapores NH3 púrpura
  Quinina amarillo, con vapores NH3 verde.
Grupo VII Cocaína, aconitina  

El procedimiento para las reacciones de la marcha de Bandford, es el mismo que el utilizado en las reacciones generales, en vidrio reloj, agregando directamente el reactivo correspondiente sobre el residuo seco. Cuando hay una variación se indica lo contrario. Para cada grupo se describe un reactivo de grupo, para el cual aparece una reacción cromática característica. En algunos grupos existen reactivos de diferenciación que permiten discriminar, con alguna certeza, cual de los alcaloides del grupo se encontró.

En la realización de la reacción general para el Grupo I pueden detectarse interferencias debidas a falta de purificación (color pardo), por carbonización de la materia orgánica.
La quinina presenta, en medio ácido, fuerte fluorescencia azulada al U.V., lo que permite identificarla con cierta seguridad.

Los alcaloides del Grupo VII se caracterizan por no dar reacciones cromáticas netas. Por ello es necesario proceder a identificarlos por otras técnicas.

La reacción de Oliver consiste en agregar al extracto seco del alcaloide una gota de solución de SO4Cu al 1% y una gota de agua oxigenada 10 vol., alcalinizando con amoníaco.

El ensayo de Vitali consiste en la evaporación a sequedad el baño maría una pequeña fracción del extracto del alcaloide con una gota de ácido nítrico fumante. El residuo pardusco obtenido se trata, una vez frío, con una o dos gotas de potasa alcohólica.

Reacciones de confirmación.

Una vez que se efectuó la marcha de Bandford, puede ser necesario confirmar la presencia de alguno de los alcaloides encontrados. Para ello se dispone de las llamadas reacciones confirmatorias.

Reacción del picrato para cocaína.

Colocar una gota de la solución a ensayar sobre un portaobjetos y llevar a sequedad. Adicionar una gota de ClH al 1% y evaporar nuevamente. Finalmente agregar una gota de ácido pícrico saturado y observar al microscopio la formación de microcristales característicos con forma de plumeritos.


Reacción de Da Silva.

Usada para la confirmación de cocaína. Sobre el extracto del éter alcalino evaporado en vidrio reloj, se agregan 2-3 gotas de potasa alcohólica, se calienta a baño maría y se observará la aparición de un característico olor a benzoato de etilo.

Reacción de Kieffer.

Se evaporan unas gotas del extracto clorofórmico, dejando enfriar. Se agrega luego una solución al 1% de (Fe(CN)6)K3. La aparición de un color azul intenso por formación de azul de prusia (Fe(CN)6)3Fe4 , da cuenta del poder reductor de la morfina por la presencia de una función fenólica.

Reacción de la tetrahidroestricnina

Se colocan en un tubo dos o tres gotas del extracto de cloroformo alcalino y se seca en baño de agua . Se agregan entonces dos granallas de zinc y 0.5 mililitros de la solución de cloruro mercúrico. Calentar en baño durante cinco minutos En una cápsula de porcelana colocar un pequeño cristal de nitrito de sodio, volcando a continuación el producto de la reducción. Calentar en baño y observar la aparición del color rosado en caso de presencia en la muestra original de estricnina.

Reacción para nicotina.

La reacción con el p-dimetilamino-benzaldehido que caracteriza a la nicotina como parte del Grupo V en la marcha de Bandford, no siempre se verifica adecuadamente. Por ello se procede a confirmar con la siguiente técnica. Se coloca en un tubo de ensayo un mililitro del reactivo vainillina clorhídrico., agregando luego, cuidadosamente por las paredes del tubo dos a tres gotas de la solución acuosa de nicotina. Aparecerá en la interfase un color rosado que se irá intensificando con el tiempo.

Reacción de la talioquinina.

Se evaporan en un tubo de ensayo, dos o tres gotas del extracto, disolviendo con 0.5 mililitros de ácido acético al 2% y 0.5% de agua destilada. Se agregan entonces dos o tres gotas de agua de bromo al 50%, cuidando de no agregar en exceso. Luego, alcalinizar con amoníaco al 20% observándose la aparición de un color verde característico.

Cromatografía en capa fina.

La técnica es similar a la utilizada para las drogas psicotrópicas de naturaleza alcalina. En ocasiones se aísla un alcaloide desde la marcha de rutina para identificación de un psicotrópico en general, y se identifica recién en la cromatografía por comparación con testigos.

La fase fija a utilizar es sílica gel G y el solvente de corrida habitual es la mezcla metanol:amoníaco (99/1)El revelado de la placa se realiza con yodoplatinato de potasio, determinando entonces los Rf.

Reactivos.

Potasa alcohólica: Se disuelven 5 gramos de KOH en 100 mililitros de etanol absoluto.
Reactivo alcohol-ácido: Se disuelve 1 gramo de p-dimetilaminobenzaldehído en 100 mililitros de etanol absoluto, con 20 gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Reactivo de Frödhe: Disolver 1 gramo de molibdato de amonio en 100 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento de usar.
Reactivo de Mandelin: Disolver 1 gramo de vanadato de sodio en 100 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. Se prepara en el momento de usar.
Reactivo de Mecke: 1 gramo de ácido selenioso se disuelve en 200 mililitros de ácido sulfúrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento se usar.
Yodoplatinato de potasio: Se disuelven 45 mililitros de yoduro de potasio al 10% y 5 mililitros de ácido cloroplatínico al 5% en 100 mililitros de agua destilada.
Reactivo de vainillina:Se disuelven 0.04 gramos de vainillina en 100 mililitros de ClH concentrado.
Cloro naciente: Agregar unos cristales de clorato de potasio a una solución concentrada de ClH.
Reactivo de Marquis: Formol concentrado.

 

CUESTIONARIO:

1- Indique situaciones en las que sea procedente investigar alcaloides en una muestra de origen biológico.

2.- Por que razón se necesita de la eliminación de las proteínas en la determinación de alcaloides y en que situaciones estima que este procedimiento no sería necesario.

3.- Cuál es el fundamento de la marcha sistemática de Bandford. ¿Por que técnicas se ve reemplazada actualmente?