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6 - ACIDO CIANHIDRICO Y CIANUROS ALCALINOS

Identificacion y dosaje de acido cianhidrico en medios biologicos

El ácido cianhídrico (HCN) es un líquido volátil, incoloro de olor característico a almendras amargas que presenta gran difusibilidad debido su elevada tensión de vapor. Las sales de cianuro (sodio o potasio) son de interés toxicológico. El cianuro de sodio es más tóxico que el de potasio porque desprende mas HCN por gramo de compuesto.
El mecanismo de acción tóxica lo ejerce inhibiendo la citocromooxidasa bloqueando de este modo la respiración celular generando hipoxia o anoxia citotóxica. También inhibe proteínas que posean hierro en su máximo estado de oxidación (+3) como es la metahemoglobina.
La sintomatología puede ser de tipo superaguda con pérdida inmediata del conocimiento, convulsiones, rigidez muscular, la muerte ocurre en pocos minutos. La intoxicación aguda presenta tres períodos. En el primero se presenta ardor y anestesia en la boca estómago, luego vértigos y zumbidos. En el segundo período se manifiesta pérdida del conocimiento con convulsiones, contractura espasmódica de maxilares, pulso irregular, cianosis. En el tercer período se presenta relajación muscular y muerte por parálisis del centro respiratorio bulbar y paro cardíaco.
. La etiología de la intoxicación con ácido cianhídrico (HCN) descripta es muy variada. Las principales fuentes de compuestos cianurados son ciertas industrias en las cuales el HCN presenta aplicaciones comerciales como son la galvanoplastia, extracción de metales preciosos (oro y plata), producción de gomas sintéticas como resinas acrílicas, poliuretano, manufactura de plásticos, así como el empleo de HCN para desinfección como insecticida y raticida.
Otra fuente de compuestos cianurados son los alimentos, como algunos productos vegetales que contienen glucósidos cianogenéticos que por hidrólisis (ácida, alcalina o enzimática) dan origen al HCN. Entre estos se encuentran especies de porotos, semillas de lino, sorgo, almendras amargas, mandioca, habas, así como en semillas de manzanas y peras y en bebidas fermentadas como el “Kirsh”, aguardiente de cerezas fermentadas.
También se ha descripto otra fuente de compuestos cianurados en el uso farmacológico como los antitusígenos como agua de laurel cerezo de uso en el pasado.
Se lo ha empleado en ejecuciones en la llamadas cámara de gas y se han registrado muchos casos de intoxicaciones voluntarias y homicidas.

1. Consideraciones generales de la analítica toxicológica

La investigación de ácido cianhídrico puede realizarse con diferentes tipos de muestra: vísceras (que necesitarán de una previa disgregación), líquidos biológicos, sangre u orina, alimentos (productos vegetales o animales) y medicamentos.
La sangre venosa presenta un color rojo vivo característico. En cadáveres frescos se observa color rojo cereza así como manchas de color rojo mas o menos intenso. Junto al olor típico a almendras amargas que desprenden los órganos se observan numerosas hemorragias pequeñas en las serosas.
El recipiente que contiene la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado herméticamente para evitar pérdidas. Si el material es visceral, no debe conservarse en formol porque reacciona con el ácido cianhídrico formando cianhidrinas de las que no se puede liberar CNH. Las muestras deben conservarse en frío para evitar la acción enzimática y bacteriana sin agregado de conservantes.
Existen tres tipos de determinaciones del ácido cianhídrico: los ensayos inmediatos o preliminares, los ensayos mediatos y los ensayos cuantitativos.

 

2. ENSAYOS CUALITATIVOS O INMEDIATOS

La identificación directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias a su elevada presión de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolíticos que ocurren con cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc.
En la atmósfera del recipiente se libera CNH que puede deberse a dos tipos de procesos: hidrolíticos y putrefactivos
Hidrolíticos

CN- + H2O CNH + OH-

El equilibrio se desplaza hacia la derecha.
En vísceras en estado putrefactivo se libera CNH de acuerdo con

CN- + CO2 + H2O CNH + CO3H-

Los ensayos inmediatos son técnicas que se realizan en la atmósfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles impregnados en diferentes reactivos:

2. 1. Utilización de papel de guayaco:

El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidación de las sales cúpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El ensayo es identificativo dado que al sistema Cu(II)-cianuro se acopla un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidación origina un derivado coloreado (de color castaño vira al azul).

Tecnica

Reactivos

Solución acuosa de sulfato de cobre al 0.2%
Solución alcohólica de resina de guayaco al 10% recién preparada.

Procedimiento

En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solución de SO4Cu al 0.2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solución alcohólica de resina de guayaco al 10% de reciente preparación. El reactivo del papel de guayaco puesto en la boca del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reacción forman un compuesto de color azul en forma inmediata.

8HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4H2 + 2 O2

Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo positivo no entrega mayores datos y requiere confirmación con ensayos específicos. El ensayo presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actúan de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre.
Es un ensayo clásico, sensible pero inespecífico. Algunos autores indican que puede reconcerse hasta 0.25 µg de ácido cianhídrico.

2.2. Ensayo con O-toluidina:

Presenta igual fundamento que la reacción anterior pero la visualización se realiza con O-toluidina. También se puede usar bencidina, fenoftaleína o cualquier sustancia que al oxidarse forme un complejo coloreado. Esta reacción es altamente sensible pero inespecífica.

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de sulfato de cobre al 0.2%
Solución alcohólica de O-toluidina al 1%.

Procedimiento

El ensayo es similar al anterior. En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rápidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el ensayo guayaco-cúprico.

2.3. Ensayo de Grignard:

El ensayo se fundamenta en que el ácido pícrico en presencia del HCN, liberado de la muestra ácida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco minutos.

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de ácido pícrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr de CO3Na2.

Procedimiento

Embeber tiras de papel filtro con solución acuosa de ácido pícrico y escurrir el exceso. Si el papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su máxima sensibilidad. El reactivo dura indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar. Un color rojo naranja indica resultado positivo.

2. 4. Ensayo de Magnin:

Se basa en la formación de azul de Prusia.

HCN + OH- CN- + H2O

Luego

6CN- + Fe+2 [Fe(CN)6] -4

Fe+2 + 2OH- Fe(OH)2 precipitado verde

2Fe(OH)2 + 1/2O2 + H2O 2Fe(OH)3

en medio HCL

Fe(OH)3 + [Fe(CN)6] -4 + 3H + + Na+ Fe(CN)6FeNa + 3H2O
  azul de prusia

Técnica

Reactivos

Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2%
Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada.

Procedimiento

Se impregna una tira de papel con hidróxido de sodio al 2% y se expone en el interior del recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cápsula de porcelana. Se distribuyen sobre la superficie expuesta 4 gotas de solución de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado verdoso que luego pasa a castaño (hidróxido férrico). Finalmente por agregado de unas gotas de ácido clorhídrico concentrado se observa color azul por formación azul de Prusia. Es una reacción poco sensible pero muy específica
Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy específica. Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento.

 

3. ENSAYOS MEDIATOS

3.1. Aislamiento e identificación del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos.

Aislamiento

Cuando se sospecha la presencia de ácido cianhídrico mediante los ensayos antes especificados, se procede al aislamiento y posterior identificación. Para la realización de los ensayos mediatos, se requiere de una separación previa del CNH de la muestra. Son adecuadas una destilación simple o una microdifusión.
En la destilación simple se agrega al material ácido tartárico. El destilado se recoge en hidróxido de sodio para evitar pérdidas del ácido cianhídrico liberado. En el caso de muestras en estado de putrefacción se debe agregar al material a destilar acetato básico de plomo para retener el ácido sulfhídrico.

Técnica

Reactivos

Acido tartárico al 10%
Hidróxido de sodio al 10%

Equipos

Aparato de destilación

Procedimiento

Colocar 10 g. del material biológico en un matraz de destilación y cubrir con agua (aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de ácido tartárico al 10% y destilar recogiendo sobre 5ml de NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formación de espuma y una vez alcanzado el punto de ebullición se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la solución alcalina. Suspender la destilación cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del volumen inicial. Medir el volumen destilado.

3.2. Técnica del azul de Prusia modificada o técnica de Chellen-Klassen

El ensayo se fundamenta en la formación de un precipitado azul por formación de azul de Prusia (ferricianuro férrico) a partir del destilado, efectuando un ajuste previo del pH a un valor de 8 para favorecer la precipitación.

Técnica

Reactivos

Solución alcohólica de fenoftaleína al 1%
Acido sulfúrico 0.1N
Solución acuosa de carbonato de calcio al 10%
Solución de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada.
Acido clorhídrico concentrado
Solución acuosa de hidróxido de bario al 10%

Procedimiento

A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solución de fenolftaleína (medio básico rosada), y luego lentamente solución diluida de ácido sulfúrico hasta vivar el indicador a incolora . Luego se lleva a pH alcalino con solución de carbonato de calcio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo. Agregar 3 gotas de solución de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar con clorhídrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de ácido fosfórico. Si aún no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de la reacción y agregar gotas de solución de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN.
Las reacciones correspondientes son las siguientes:

2 CNK + Fe(OH)2 Fe(CN)2 + KOH

Fe(CN)2 + CNK [Fe(CN)6K]4

Se agrega HCl y se agita:

[Fe(CN)6]K4 + Fe(OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O

[Fe(CN)6]FeK + FeCl3 [Fe(CN6]3Fe4 (Azul de Prusia ) + KCl

Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observará un botón blanco azulado.
La sensibilidad de la reacción es de hasta 10 µg de ión cianuro. Con el agregado de cloruro de bario se puede revelar hasta 5 µg de ión cianuro.

3.3. Reacción sulfociánica o de Von Liebig.

El método consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solución formándose ácido sulfocianhídrico que con cloruro férrico aparece color rojo.

Técnica

Reactivos

Solución de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro)
Acido clorhídrico concentrado
Solución rojo Congo
Solución acuosa de cloruro férrico al 0.5%
Eter etílico

Procedimiento

Unos 5 ml de destilado se colocan en una cápsula de porcelana y se agregan unas gotas de polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre tela metálica, agitando el líquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solución se decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de color amarillo se considera prácticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se acidifica con solución concentrada de HCl hasta reacción ácida frente al rojo congo. El compuesto puede aislarse por tratamiento con éter etílico realizando tres extracciones con 20, 10 y 10 ml de éter cada una. Los extractos etéreos se evaporan en cápsula de porcelana y dejar evaporar el eter a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro férrico al 0.5% y aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 µg de HCN transformado en SCN- el color aparece rápidamente)

CN - + (S)m-2 SCN - + (S)n-1-2

2SCN- + Fe+3 [Fe(SCN)2]+ (complejo color rojo)

El ensayo es altamente sensible y específico. Algunos autores estiman que es posible revelar ión cianuro en la proporción de 100 µg/L.

 

4. ENSAYOS CUANTITATIVOS

Los ensayos cuantitativos permiten valorar la cantidad del tóxico

4.1. Método de Denigés

Constituye una valoración en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+ en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el ión ioduro de acuerdo con las siguientes reacciones

CN- + AgNO3 AgCN +NO3 -

AgCN + CN- [Ag(CN)2]- (Complejo Soluble)

[Ag(CN)2]- + Ag+ Ag(CN)2Ag (se forma antes del pto. final)

Se corrige con NH3

Ag(CN)2- + NH3 Ag(NH3)2+ + 2 Ag(CN-)2

Ag+(exceso) + I- AgI amarillo

Técnica

Reactivos

Amoníaco concentrado
Ioduro de potasio al 10%
Solución de nitrato de plata 0.01N

Procedimiento

Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amoníaco concentrado y 1 ml de KI al 10%. Titular con solución de nitrato de plata 0.01N hasta aparición de turbiedad permanente.

Cálculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN.

4.2. Determinación de cianuro en alimentos, sangre e hígado.

Método de formación de manchas de azul de prusia

El método se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por acción del ácido sulfúrico o ácido tricloroacético y aspirado a través de un disco de papel impregnado en sulfato ferroso y se forma ion férrico visualizado como manchas de ferrocianuroferrico (azul de Prusia). El disco es luego sumergido en ácido clorhídrico hasta que toda la porción sin reaccionar sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro presente en la muestra.

Reactivos

1) ß- glucosidasa
2) Agente antiespumante
3) Solución acuosa al 11% de cloruro férrico: pesar 11g de cloruro férrico y llevar a 100 ml con agua destilada.
4) Solución acuosa de sulfato ferroso amónico al 19%: pesar 19 g de (NH4)2Fe(SO4)2) y llevar a 100 ml con agua destilada.
5) Solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con agua destilada.
6) Solución acuosa de 1N de hidróxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada.
7) Solución stock de cianhídrico (1000 µg/ml): pesar 0.2503 g de cianuro de potasio y transferir en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada.
8) Solución standard intermedia de cianhídrico (100µg/ml): diluir 1 ml de la solución stock de cianhídrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
9) Solución de trabajo de cianhídrico (10 µg/ml): diluir 5 ml de la solución intermedia standard de cianhídrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
10) Solución acuosa al 20% de ácido sulfúrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de 100 ml. Agregar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y llevar al volumen con agua destilada.
11) Solución de ácido clorhídrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml, agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada.
12) Papel de filtro Watman Nº 40 cortado en forma de discos 16 mm diámetro.

Aparatos y equipos

1) Aparato para cianhídrico (Fig. 3 )
2) Baño de agua a 75ºC.
3) Bomba de aire
4) Baño de vapor o evaporador.

Procedimiento - Pretratamiento de alimentos

1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador
2. Agregar 200 ml de agua y 0.02g de ß glucosidasa
3. Homogenizar durante 4 minutos.
4. Dejar decantar 1 hora.
5. Proceder al paso 10 del análisis.

Pretratamiento en muestras de sangre

1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a un probeta de 500 ml.
2. Reemplace el tapón de goma en el aparato de cianhídrico con el tapón ajustado en la probeta de 500 ml.
4. Prepare suficiente cantidad de agua caliente (paso 5 del análisis) que pueda contener la probeta de 500 ml.

Pretratamiento para muestras de hígado.

1. Agregue 1 gota de agente antiespumante a la muestra de hígado

Procedimiento

1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0.5 ml de solución standard de trabajo en el tubo.
2) Agregar 20 µl de cada uno de los siguientes reactivos FeCl3 11%, (NH4 )2 Fe(SO4 )2 ) 19%, y NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de diámetro.
3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhídrico mientras esté húmedo y ensamble el aparato.
4) Agregar 1.0 ml de ácido sulfúrico/g de standard con una jeringa a través de la entrada del tubo de aire al tubo muestra.
5) Ubicar el tubo en baño de agua a 75º.
6) Aplicar succión durante 4 minutos. Menor tiempo de succión puede dar incompleta recuperación y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco.
7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en baño de vapor o en plancha calefactora) hasta que el papel es vea blanco con manchas azul.
8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en línea sobre un fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que tienden a desaparecer al ubicar el papel en HCl.
9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 µg, 20 µg y 50 µg standard.
10) Colocar una porción de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5-20 µg de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra.
11) Agregue 1ml de ácido sulfúrico por gramo de muestra. Como mínimo de 1 ml, pudiendo agregarse más volumen si la muestra es básica.
12) Repetir los paso 5-8.
13) Repetir el análisis de la muestra con un sobreagregado de 5 µg.
14) Puede usarse una comparación visual o cuantificar en un densitómetro.
15) Construir la curva de calibración usando los standard de cianuro y determinar los niveles en la muestra por comparación de absorbancia. Informar en ppm.
Consideraciones generales: Medir el pH del contenido estomacal. Si el pH es ácido, el ión cianuro es probable que se haya perdido.

4.3. Método de microdifusión de Feldstein-Klendshoj.

Fundamento: en la cápsula de Conway el ácido cianhídrico difunde del compartimiento externo al interno siendo fijado como cianuro en la solución alcalina. Se toma una alícuota del compartimiento interno y se agrega cloramina T, formándose cloruro de cianógeno. Luego por el agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina.
La acción hidrolítica determina la apertura del anillo piridínico, para dar lugar a la formación del ácido glutacónico. Si este derivado se hace reaccionar con ácido barbitúrico se forma un complejo rojo que se lee a 580 nm.

Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vísceras.

Reactivos

1) Hidróxido de sodio 0.1N
2) Acido sulfúrico 10% en volumen
3) Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina sólida y 1 parte de parafina.
4) Fosfato monosódico 1M.
5) Cloramina T al 0.25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar.
6) Reactivo piridina-barbitúrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de ácido barbitúrico, 15 ml de piridina purísima y 3 ml de ácido clorhídrico concentrado. Mezclar hasta disolución total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar.

Instrumental

1) Espectrofotómetro
2) Cubetas de sección cuadrada de 1 cm de paso de luz.
3) Cámaras de Conway

Procedimiento

Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusión de Conway 3.3 ml de hidróxido de sodio 0.1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de homogenato de tejido (equivalente a 1 g. de tejido). Como reactivo liberante se agregan 2 a 3 gotas de ácido sulfúrico al 10% en el compartimiento externo. Tapar inmediatamente y homogenizar por rotación. El tiempo de difusión es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solución alcalina del compartimiento interno y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de hidróxido de sodio 0.1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosato monosódico 1M y 1 ml de cloramina T al 0.25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por último 3 ml de reactivo piridina-barbitúrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de ión cianuro aparece color rosado cuya absorbancia se mide a 580nm.
Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre 0.1 a 2.0 g/ml de solución de hidróxico de sodio 0.1N.

5. Valores normales de cianuro en individuo adulto

El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas cantidades. Hasta 15 µg/100 ml sangre es considerado como valor normal.

6. Interpretación de los resultados

En una intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico valores mayores de 100 ?g/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro.
La ingestión de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de 70 Kg pudiendo llegar la concentración sanguínea a valores 1 –2 mg/100 ml o superiores.
En muestras de sangre cadavérica, el cianuro desaparece rápidamente por acción enzimática y bacteriana. Hasta 15 µg/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas cantidades.
En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/L es asociado con casos fatales.

Dosis tóxica: una concentración de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal.

 

7. CUESTIONARIO

1) Describa el mecanismo de acción del ácido cianhídrico

2) Sobre que tipo de muestras se puede realizar las determinaciones de ácido cianhídrico. Indique la forma correcta de toma de muestra y conservación en cada caso. Que ocurre con muestras en estado de putrefacción.

3) Como procede para la identificación y cuantificación de ácido cianhídrico en medios biológicos

4) De los métodos descriptos, describa las ventajas y desventajas de cada uno así como las posibles interferencias.