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5 - MONÓXIDO DE CARBONO

Características generales de la intoxicación y mecanismo de acción.

El monóxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, insípido y no irritante que se origina durante la combustión incompleta del carbón. Las fuentes productoras más frecuentes son estufas, calefones, hornos, incineradores, automóviles etc en mal funcionamiento. La toxicidad del monóxido de carbono (CO) se debe a su combinación con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina (COHb). En dicha forma la hemoglobina no transporta oxígeno, dado que ambos gases (O2 y CO) reaccionan con el grupo hemo en la molécula tetramérica de la hemoglobina. Sin embargo, la afinidad del monóxido de carbono por la hemoglobina es cerca de 240 veces mayor que por el oxígeno, de esta manera, la intoxicación puede ocurrir aún cuando pequeñas cantidades de CO se encuentren presentes en la atmósfera. Cuando el paciente es removido del ambiente contaminado, la carboxihemoglobina desaparece rápidamente, particularmente cuando el oxígeno es administrado. Solo trazas pueden ser detectadas cuando el paciente alcanza el hospital y de esta manera la medida de carboxihemoglobina es raramente justificada en la clínica toxicológica.

CO +Hb.Fe.O₂ <=======> Hb.Fe.CO + O₂

La formación de oxihemoglobina (Hb.Fe.O2) como de carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO) son reacciones reversibles y dependen principalmente de la presión parcial de los gases y del pH sanguíneo aunque otros factores como la temperatura y la concentración iónica tienen también incidencia.
La toxicidad del monóxido de carbono se manifiesta no sólo de la interferencia en el aporte de oxígeno por la sangre sino también ejerce efecto directo al unirse a los citocromos celulares como los presentes en las enzinas respiratorias y la mioglobina.

Consideraciones generales en la analítica toxicológica

El aspecto del cadáver y el color carminado de las vísceras constituyen manifestaciones propias de la intoxicación oxicarbonada aguda. Dicho color resulta visible en los órganos como cerebro, corazón, pulmones y musculatura voluntaria. En los casos en que el sujeto está vivo, la sangre deberá extraerse, a lo sumo hasta dos horas después de la exposición, puesto que gran parte del monóxido resulta eliminado por vía pulmonar. Para casos mortales, la muestra de sangre deberá extraerse lo más rápido posible antes que se inicien los procesos putrefactivos. Se ha demostrado que el monóxido de carbono no se absorbe post-mortem constituyendo su determinación un índice del contenido en el momento de la muerte. La carboxihemoglobina es un derivado muy estable y su presencia en sangre puede demostrarse después de la descomposición cadavérica así como en cadáveres sometidos a altas temperaturas. El color carminado típico de la carboxihemoglobina se observa en muestras de sangre cuando el porcentaje de saturación es del 30% o superior, distinguiéndose fácilmente de la oxihemoglobina o de la hemoglobina misma.

Toma de muestra

La recolección de la muestra de sangre debe ser obtenida por punción venosa con anticoagulante (heparina) evitando la formación de burbujas o la entrada de aire a la jeringa. Se recomienda obtener sangre del corazón o de las venas gruesas como la femoral. El recipiente a utilizar para la conservación de la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado en forma hermética.

Determinación analítica de carboxihemoglobina.

La determinación cuantitativa de la carboxihemoglogina en sangre puede realizarse por métodos espectroscópicos que se basan en los diferentes espectros de absorción que presentan la carboxihemoglobina respecto de la hemoglobina. En todos ellos se realizan medidas de absorción a distintas longitudes de onda de diluciones adecuadas de la sangre en estudio. Estas longitudes de onda corresponden a los máximos, mínimos o puntos isosbésticos de absorción de cada una de las especies de hemoglobinaque coexisten en la muestra.
Otra propiedad que es aprovechada por estos métodos es la gran estabilidad que presenta la carboxihemoglobina respecto de la oxihemoglobina frente a reactivos reductores o metahemoglobinizantes. A ojo desnudo, la sangre con alto contenido de carboxihemoglobina presenta un marcado tono carmín, mientras que la sangre con alto contenido de metahemoglobina es chocolate.
Algunos métodos además implican la medida de la absorción de la muestra a longitudes de onda que corresponden a puntos isosbésticos de los espectros correspondientes a los efectos de realizar correcciones a las relaciones encontradas para los máximos de absorción.
Se describen a continuación ensayos de tipo cualitativos que presentan carácter práctico para su identificación.

a)Ensayo de dilución
El ensayo de dilución consiste en preparar soluciones sanguíneas al 1% de muestra a analizar y de sangre normal. Se observa simultáneamente ambos tubos de ensayo con luz natural difusa. La sangre normal presenta color rojo amarillento, mientras la muestra, si contiene carboxihemoglobina, presenta color carminado neto. Este ensayo es seguro y práctico. Este ensayo es estable con concentraciones de hemoglobina superiores al 20%

b) Ensayo alcalino
Se basa en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina con respecto a la hemoglobina en similares condiciones alcalinas.
En un tubo de ensayo colocar 3 a 4 gotas de la sangre a analizar y en otro tubo similar colocar igual número de gotas de sangre normal, agregar 15 ml de agua destilada y mezclar bien. Agregar a cada tubo 5 gotas de solución de hidróxido de sodio al 10% y mezclar bien. La sangre normal adquiere color castaño a castaño verdoso (hematina alcalina), mientras que la sangre oxicarbonada permanece inalterada (color carminado durante cierto tiempo). El ensayo ofrece un neto contraste y resulta positivo cuando la concentración de carboxihemoglobina es superior al 10%. La sangre fetal interfiere en este ensayo dado que última produce una transformación retardada frente al hidróxido de sodio.
A continuación se describen diferentes métodos para la identificación y cuantificación de carboxihemoglobina en sangre: examen espectroscópico, espectrofotométrico, cromatografía gaseosa e infra rojo.
Identificación de carboxihemoglobina por el método espectroscópico

El examen espectroscópico se basa en la absorción selectiva que, a determinadas longitudes de onda del espectro visible, presentan la hemoglobina y sus derivados en diluciones convenientes.
Las soluciones de oxihemoglobina al 1-2% observadas al espectroscopio presentan características identificativas de aplicación práctica que, en la zona visible se destacan entre las rayas D y E del espectro. La carboxihemoglobina, en similar dilución presenta un espectro de absorción muy similar aunque desplazado en su posición con respecto a la oxihemoglobina.
La dilución de oxihemoglobina presenta dos bandas de absorción, cuyas posiciones son: banda (izquierda): 586-566 nm, banda ß (derecha): 550-528 nm.
Las bandas de la carboxihemoglobina presentan los siguientes límites: banda : 580-560 nm, banda ß: 546-526 nm.
En los espectroscopios de bajo poder resolutivo esa diferencia es poco neta por lo que es necesario fijar la diferencia. Ello se hace volatilizando NaCl utilizando un mechero colocado frente a la abertura del colimador entre ésta y la solución sanguínea testigo. Al agregar ditionito de sodio (S2O4⁼) la HbO₂ es reducida, desapareciendo las bandas y ß y se forma una banda ancha (Banda de Stokes) entre los 590 nm 540 nm más débil, mientras que la carboxihemoglobina no se modifica frente al tratamiento con el reductor.

FeHbO₂ + S₂O₄⁼ HbFe + 2 SO₃⁼

Para la identificación de HBCO se fija la raya D del espectro de emisión de Na con un punto arbitrario de la escala. Luego, se prepara una solución al 1% de sangre oxigenada y se observa el espectro. Luego, se prepara una solución al 1% de sangre con HbCO y se observa el espectro. Se realizan mezclas de HbO2 y HbCO y se determina la mínima [COHb]. Se reduce la HbO₂ con S₂O₄⁼ y se observa el espectro. A continuación se coloca igual dilución de la sangre en estudio. Si se observan las mismas posiciones relativas de las bandas en los espectros, la sangre en examen no contiene carboxihemoglobina o su presencia está por debajo del índice de detección. En cambio, de contener carboxihemoglobina se observará un desplazamiento de ambas bandas hacia la región violeta del espectro. Al agregar el ditionito de sodio, la sangre normal presenta la banda de Stockes que cubre el espectro. La sangre carboxigenada no modifica las bandas originales. En los casos de elevado contenido de carboxihemoglobina como ocurre en los casos mortales, la diferenciación con el pigmento normal mediante el tratamiento reductor no ofrece inconveniente alguno, pero en los casos en que el sujeto intoxicado ha sido retirado del ambiente contaminado y sometido a tratamiento con oxígeno, la sangre puede acusar un menor tenor en carboxihemoglobina.
Al tratar la dilución sanguínea con el ditionito, la oxihemoglobina prevalece, se reduce y la banda de Stokes cubre el espacio libre existente entre las dos bandas de la carboxihemoglobina que no resulta alterada por adición del reductor. La Fig. 1 presenta los espectros de absorción oxihemoglobina, hemoglobina reducida y carboxihemoglobina. La carboxihemoglobina deberá identificarse por otros procedimientos (microdifusión, extracción etc.).
En general se considera la sensibilidad de este método equivale a 3.2 ml de monóxido de carbono por 100 ml de sangre total. Entre las causas de error se encuentra la sangre alterada que pueda contener hematina alcalina la que al reducirse se transforma en hemocromógeno y su espectro puede confundirse con el de la carboxihemoglobina.

Fig. 1: Espectros de absorción de a) oxihemoglobina, b) hemoglobina reducida y c) carboxihemoglobina

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina
Método espectrofotométrico

Algunos métodos espectrofotométricos emplean el sistema oxihemoglobina- carboxihemoglobina. El siguiente método se basa en el hecho que la sangre normal contiene varias formas de hemoglobina (la forma reducida, la forma oxidada, y pequeña cantidades de metahemoglobina), y si un agente reductor como el ditionito de sodio es agregado a la sangre, la forma oxigenada y la metahemoglobina son cuantitativamente convertidas a la forma reducida la cual presenta un espectro como se presenta en la Fig. 2.
El monóxido de carbono presenta mayor afinidad por la hemoglobina que el oxígeno mientras que la carboxihemoglobina no es reducida por el ditionito de sodio. Así, la carboxihemoglobina permanece sin modificarse como se muestra en la curva A del espectro en la Fig. aún cuando se ha realizado un tratamiento con ditionito de sodio.
En la Fig. 2 se observa que la máxima diferencia de absorbancia para los espectros de carboxihemoglobina (A) y hemoglobina reducida (B) se presenta a 540 nm, mientras que 579 nm presenta la misma absorbancia (punto isosbéstico). El porcentaje de saturación de monóxido de carbono en una muestra de sangre puede calcularse de la medida de la absorbancia a esa longitud de onda de la muestra saturada con monóxido de carbono (A), la muestra libre de monóxido de carbono (B) y la muestra sin tratar (C) luego de la reducción con ditionito de sodio.

Fig. 2: Espectros de absorción de (A) carboxihemoglobina, (B) hemoglobina reducida y (C) y muestra de sangre de paciente intoxicado con monóxido de carbono.

El método de Amenta (1963) y luego modificado por Heilmeyer trata la sangre con amoníaco diluido y determina la absorbancia a 575 nm, 560 nm y 498 nm. La relación obtenida es comparada con las soluciones patrones de oxihemoglobina y de carboxihemoglobina calculándose así el porcentaje de carboxihemoglobina

R= (A ₅₇₅ - A ₅₆₀) A ₄₉₆

A 498 nm es el punto isosbéstico, los pequeños errores en el ajuste de la longitud de onda no afecta mayoritariamente las lecturas de absorbancia. Las longitudes de onda de 560 y 575 representan aproximadamente los puntos mínimos y máximos de la gráfica del espectro de absorción de la oxihemoglobina los que pueden ajustarse en las escalas de la mayoría de los espectrofotómetros.

El método propuesto por Curry, mide la absorción de diluciones similares de muestra a 514 nm (máximo para HbO₂)), 560 nm (mínimo para HbO₂) y 576 nm (máximo para HbO₂). El porcentaje de saturación de la muestra se obtiene a partir de los coeficientes A ₅₇₆/A ₅₆₀ y A ₅₄₁/A ₅₈₀ .

El método de Commins se separa la muestra en dos alícuotas, un de las cuales es tratada con un exceso de oxígeno para obtener un 100% de HbO₂. Luego se mide la absorbancia a 420 nm para ambas muestras que corresponde a un punto de máxima diferencia entre los espectros de HbO₂ y HbCO y se compara luego con una curva patrón preparada con concentraciones conocidas de HbCO.

El método de Sanderson se basa en la existencia de un punto isosbéstico para los espectros de la mHb y la HbCO en los 579nm. De esta manera, luego de diluir la sangre y tratarla con un adecuado reductor, se calcula la pendiente del espectro de la muestra problema alrededor de este punto por medidas a 575nm y 585nm.

El método propuesto por Panell (1981) corresponde a una modificación de Commins y no presenta el inconveniente de tener que trabajar con sangre fresca, pudiendo utilizarse entonces para muestras forenses existe un alto nivel de mHb y otros derivados modificados de la Hb que interfieren en los métodos anteriores. Utiliza como agente reductor el ditionito de sodio. En este método se realizan medidas respecto a la sangre oxigenada a 435nm, 421nm, 570nm y 620nm aplicándose la siguiente relación para la obtención del porcentaje de saturación de HbCO:

El valor de F se determina experimentalmente por mediciones realizadas sobre sangre saturada con oxígeno, es decir, con 0% de HbCO.

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina mediante separación física de la carboxihemoglobina de otras hemoglobinas

El método se basa en la alta resistencia relativa de HbCO al calor mientras que las otras formas de hemoglobina sufren coagulación. Esta técnica es simple de realizar y permite ser aplicada con resultados reproducibles si se mantienen estrictamente las condiciones indicadas: calentamiento a 55 ± 0.5ºC durante 5 minutos y pH 5.05 ± 0.05.

Reactivos

1. Buffer acetato. Mezclar 1 volumen de solución 1 (300 g de ácido acético glacial en 1 litro de agua destilada) mas 3 volúmenes de solución 2 (408 g de acetato de sodio CH₃COONa.3H₂O disuelto en 1 litro de agua). El pH no debe variar de 5.05 ± 0.05.
2. Antiespumante. Mezclar el antiespumante con agua al 1% y se agita vigorosamente con algunas perlas de vidrio.

Equipos

Baño termostático de agua a 55 ± 0.05ºC
Centrífuga a 5000 rpm. Capacidad 4 o más tubos de 10-15 ml.
Especrofotómetro UV visible

Procedimiento

5 ml de sangre a analizar previamente homogenizada cuidadosamente se mezclan con 15 de agua destilada y 1 ml de antiespumante por inversión. La mitad de esta solución es separada en un tubo, rotulada y guardada en oscuridad. La otra mitad es saturada con CO durante 30 minutos asegurándose que el volumen de la solución sanguínea no cambie. Para cada una de las soluciones (la sin tratar y la tratada con CO) dos alícuotas de 1.0 ml son ubicadas en 4 tubos de centrífuga conteniendo 4.0 ml de buffer acetato. Después de mezclar por inmersión dos veces cada tubo, los tubos se ubican en un baño termostático de agua a 55.0 ± 0.5ºC exactamente por 5 minutos. Luego los tubos se enfrían en agua fría durante otros 5 minutos y centrifugados a 5000 rpm durante 5 minutos. Dos ml de cada uno de los cuatro sobrenadantes se diluyen con 10.0 ml de agua destilada y se mezclan 2 o 3 veces por inmersión en el tubo.Para la lectura se requieren tres cubetas: cubeta 1 (blanco) es llenada con agua destilada, cubeta 2 es llenada con la solución de sangre sin tratar y cubeta 3 con solución de sangre saturada con CO. La absorbancia de las dos soluciones se leen contra agua a 570 mn y 630 nm. Luego de la lectura, la cubeta 2 es vaciada y llenada con el duplicado de la solución de sangre sin tratar. La cubeta 3 también luego de la lectura es vaciada y llenada con el duplicado de la solución de sangre saturada con CO. De esta manera no se requiere enjuague. Se repite la lectura a 570 y 630 nm.

Los cálculos se realizan mediante la siguiente relación

Los valores duplicados no deben variar mas de 2 a 3 % de saturación de COHb. Con valores de saturación de COHb menores a 20% dos tipos de dificultades pueden presentarse: primero, la lectura en el espectrofotómetro de muestra sin tratar es baja e incierta. Segundo, la coprecipitación de COHb con el precipitado de los derivados de hemoglobina puede ser un factor importante que tiende a disminuir la cantidad residual de COHb en el sobrenadante. El método arroja resultados reproducibles cuando la saturación de COHb es superior al 20%. Asimismo, el método es moderadamente sensible a los cambios que ocurren en la sangre luego del proceso postmortem.

CROMATOGRAFÍA GASEOSA

La cromatografía gaseosa se considera una metodología universal para la determinación de compuestos con una presión de vapor lo suficientemente alta, por lo que en general se consideraría adecuada para tóxicos volátiles y gaseosos. Aún esto, la determinación de mon6xído de carbono por CG presenta diversos inconvenientes que es necesario tomar en cuenta en el momento de optar o no por la utilización de esta metodología.
Por un lado la elevada presión de vapor del monóxido de carbono requiere de columnas y/o de programas que sean capaces de separar al analíto de los gases utilizados como carrier, helio o nitrógeno generalmente y de otros gases que pudiesen coexistir con el CO como el C0₂. Este inconveniente se subsana utilizando columnas capilares y programas de corrida cromatográfica que trabajan comenzando a temperaturas subambiente, típicamente a -20"C. Los equipos requeridos para estas condiciones cromatográficas son muy poco frecuentes en laboratorios de toxicología.
Por otro lado, la detección de la señal de monóxido de carbono a la salida de la columna CG se realiza mediante dos metodologías posibles. Una forma es la utilización de una post columna con un catalizador y condiciones de hidrogenación adecuadas para transformar al monóxido de carbono cuantitativamente en metano, luego de los cual este es medido por un detector común iónico de llama (FID). La otra forma es la utilización de un detector de conductividad térmica. Ni el detector de conductividad térmica, ni el catalizador post columna son elementos comunes en un laboratorio dedicado a la toxicología.
Finalmente, se ha reportado que la cromatografía gaseosa de monóxido de carbono tiene una adecuada respuesta señal / concentración sólo para niveles de monóxido por encima del 20% en sangre, de manera que no respondería bien para medidas en individuos con intoxicaciones subclínicas o para comparar individuos con niveles normales de CO en sangre.

Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina por el método de Espectrofotometría infrarroja

En la determinación de monóxido de carbono en sangre y aire espirado, la espectrofotometría infrarroja confiere adecuada especificidad, condición que no presentan otros recursos analíticos depurados tales como cromatografía gaseosa. El procedimiento comienza con una extracción de los gases totales físicamente disueltos o combinados con la hemoglobina.
El monóxido de carbono presenta al infrarrojo dos picos de absorción a 2120 y 2170 cm^-1 (4.6-4.7 m) y no presenta otra absorción en el ámbito comprendido entre 700-4000 cm^-1. Los gases que absorben en esta región del espectro y que por lo tanto interfieren, son el diazometano, cloruro de nitrosilo y propano que muy difícilmente pueden hallarse en muestras de sangre. El dióxido de carbono puede mostrar interferencias cuantitativas por su elevada concentración relativa aún si su absorción máxima difiere de la del monóxido de carbono. Estas interferencias quedan excluidas con la adopción de sistemas de compensación o filtros adecuados.
Los equipos permiten determinar monóxido de carbono en un rango de 0 a 1000 ppm. En el análisis de sangre, la espectrofotometría infrarroja utiliza un volumen total determinado de 1 a 5 ml. El mismo se trata con ferrricianuro ácido y los gases liberados se analizan en el espectrofotómetro infrarojo.
Para establecer el porcentaje de saturación o el coeficiente intoxicación debe saturarse otra fracción de la muestra con monóxido de carbono y analizarse en la misma forma, efectuando la pertinente corrección por el monóxido de carbono físicamente disuelto. Con adecuadas modificaciones, la espectrofotometría infrarroja posibilita el registro continuo de monóxido de carbono en aire (detectores o registradores continuos).
Por otra parte, los ensayos en aire espirado permitieron revelar su presencia en forma inmediata así como después de 30 minutos de haber fumado un cigarrillo.

Determinación de monoxido de carbono en sangre por métodos químicos

Los métodos químicos emplean la cualidad del monóxido de carbono de reducir diversas sales metálicas oxidantes. Uno de los elementos metálicos de mayor aceptación lo constituye el paladio II. La propiedad reductora del monóxido de carbono se traduce en la siguiente forma:

Pd⁺² + CO + H₂O Pdº + CO₂ + 2H⁺

Este principio se emplea de diversas formas, una de ellas es el método de Gettler y Freimuth y otra variante es el de microdifusión

Método de Gettler y Freimuth

El monóxido de carbono liberado de la carboxihemoglobina por el ferrocianuro de potasio es arrastrado por aireación y pasado a través de un disco de papel sensibilizado con ClPd₂. El CO produce una mancha oscura sobre el papel de filtro debido a la reacción de del paladio que se reduce a Pdº. Por comparación de la intensidad de la mancha con muestras patrones, se puede obtener una concentración aproximada a la cantidad de CO presente en la muestra.

Técnica

Reactivos
Solución de cloruro de paladio (0.5g de cloruro de paladio, 0.5 ml de clorhídrico concentrado se llevan a 50 ml con agua destilada.
Solución ferricianuro de potasio-saponina: Ferricianuro de potasio 32 g, saponina 0.8 g agua bidestilada 100 ml.
Solución de ácido láctico (D:1.20) y llevar a 100 ml
Solución de acetato de plomo al 10%
Alcohol caprílico
Solución de cloruro cuproso amoniacal

Equipos

Fig. 3: Dispositivo empleado en la determinación de monóxido de carbono en sangre

Tres tubos de vidrio grueso con borde de 13 a 15 cm de largo y 2 cm diámetro.
Flange (dos discos de vidrio enfrentados para retención de papel de filtro)
Frasco de Mariotte
Pinzas de Hoffman
Perlas de vidrio

Procedimiento

El dispositivo se presenta en la Figura 3. El tubo A contiene 5 ml de solución de cloruro cuproso amoniacal para retener monóxido de carbono del aire e interferencias del medio del laboratorio. El tubo B contiene 2.0 ml de sangre y se añaden 4 ml de ferricianuro-saponina y 2 ml de solución de ácido láctico junto con 2 gotas de alcohol caprílico. El tubo C contiene perlas de vidrio en cantidad que alcancen 4 cm de altura y 5 ml de acetato de plomo. Entre los discos del flange se coloca un disco de papel de filtro Whatman Nº 3 cortado en forma circular humectado con la solución de cloruro de paladio y sujetado en forma segura mediante dos gomitas para lograr el cierre hermético. Se hace burbujear aire a través del dispositivo aflojando la llave del frasco de Mariotte. La velocidad de escurrimiento debe ser de 26 ml/minuto. Después de 15 minutos, se detiene el burbujeo y se retira el papel reactivo, se lava con agua destilada para eliminar el exceso de solución de cloruro de paladio y la mancha obtenida. Finalmente se compara con la escala tipo obteniéndose el grado de saturación de la sangre con respecto al monóxido de carbono.
La preparación de la escala se realiza saturando 10 ml de sangre oxalatada con un contenido de hemoglobina de 80%-90% con monóxido de carbono puro, el cual se obtiene por descomposición del formiato de sodio por acción del ácido sulfúrico concentrado. Se hace burbujear el gas en la muestra de sangre durante 15 minutos. Mezclando volúmenes iguales de la muestra saturada con sangre normal, se obtiene un grado de saturación equivalente al 50%, el cual se utiliza para la preparación de la escala mezclando diferentes volúmenes de sangre normal y sangre saturada con monóxido de carbono (Tabla 1). Cada muestra diluida en la forma expresada se somete al procedimiento señalado a fin de obtener las manchas testigo. La preparación de manchas para grados de saturación mayores al 50% no es necesaria en la práctica debido a que nunca se alcanzan valores superiores al 50% de saturación.
Dado que la capacidad de saturación de la sangre para el monóxido de carbono reside en el contenido de hemoglobina debe aplicarse el factor de corrección correspondiente para cada caso.

Tabla 1: Preparación de la escala de saturación de monóxido de carbono

CUESTIONARIO

1) Cual es el mecanismo de acción del monóxido de carbono

2) Describa la etiología de las intoxicaciones

3) Como procede para la toma de muestra y como realiza la determinación analítica correspondiente.

4) Que tipo de interferencias presentan los métodos descriptos.