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2 - LABORATORIO: TOXICOLOGIA DE URGENCIA

GENERALIDADES:

Se incluye un grupo de sustancias que comúnmente producen intoxicaciones que pueden ser de evolución mortal, lo cual muchas veces puede evitarse por la celeridad del tratamiento aconsejado en cada caso.

De ahí la importancia de este capítulo de la toxicología, en la cual se usarán para la identificación de dichas sustancias, reacciones relativamente simples, rápidas y en algunos casos específicas.

Se va a investigar en una muestra de orina tanto drogas de carácter ácido como básico, por lo tanto se procederá a realizar una extracción en medio ácido, obteniendo la fracción "éter ácido" y de la fase acuosa que resultó de esta extracción, se procederá a alcalinizar y realizándose otra extracción para obtener la fracción "éter alcalino".

Con otra fracción de la muestra de orina se procederá a realizar la hidrólisis ácida, a partir de la cual se investigará metabolitos de ciertos psicofármacos.

MUESTRA: ORINA

PROCEDIMIENTO:

Acidificar un volumen de orina (aproximadamente 20 ml) con ClH o S04H2 10%, hasta lograr un pH=2. Colocar en ampolla de decantación y extraer con 10 ml de éter etílico , agitar suavemente tratando de evitar la formación de emulsiones, dejar reposar para que se separen las fases. Recoger la fase orgánica en vaso de ppdo. y realizar otra extracción con otros 10 ml de éter etílico, agitar y dejar separar las fases, juntar esta fase orgánica con la anterior en el vaso de ppdo, (guardar la fase acuosa para realizar la extracción en medio alcalino).

Lavar los extractos con solución saturada de NaCI, separar las fases y secar la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, filtrar, recoger los extractos en vaso de ppdo. para posteriormente concentrados.

A partir de la fase acuosa se alcalinizar con aproximadamente 5 ml de NH3 , controlar el pH que no supere valores de 8 ó 9, realizar dos extracciones con 10 ml de éter etílico cada una y se procede igual que en la extracción ácida.

La concentración de los extractos se lleva a cabo sobre plancha calefactora ADVERTENCIA: CONTROLAR TEMPERATURA o en baño de María hirviente, PREVIAMENTE APAGADO EL MECHERO

Hidrólisis ácida: Se toman 10 ml de orina y se le agregan 4 ml de ClH concentrado, se calienta a ebullición durante 30 minutos, previa adaptación de un refrigerante a reflujo. Dejar enfriar, alcalinizar con NH3 concentrado, no superando pH= 10. Realizar dos extracciones con 10 ml de éter etílico, secar los extractos etéreos con sulfato de sodio anhidro, filtrar y evaporar en plancha calefactora hasta sequedad, teniendo los cuidados anteriormente citados. Tomar el residuo con 5 ml de CIH 6 N.

Se procederá luego a realizar con los extractos alcalino, ácido y el proveniente de la hidrólisis, reacciones de caracterización y dos TLC ( ácida y alcalina), investigando las drogas correspondientes en cada caso.

 

REACCIONES COLORIMETRICAS:

Fenotiazinas:

1) Reacción con reactivo FPN: A 0,5 ml del extracto se le agregan unas gotas del reactivo FPN. Observar los diferentes colores.
Esta reacción tiene valor cuando da negativo, ya que permite afirmar que no hay fenotiazinas.

2) Reacción de Denigés: A 0,5 ml del extracto etéreo se le agrega 0,5 ml de CIH concentrado. Observar los distintos colores.
Agregar una granalla de Zn, calentar a baño de María durante 5 minutos hasta decoloración, separar la granalla, enfriar y agregar dos gotas de N02Na al 1 %, formando dos capas. En la interfase aparece un color similar al de la salificación con ClH, que por agitación desaparece.

Benzodiacepinas:

Reacción de Bratton Marshall

En dos tubos rotulados: B (blanco) D (desconocido)
Extracto clorhídrico (ml) 1 1
CIH 6N (ml) 2 2
Agua destilada (ml) 2 2
Nitrito de sodio 0, 1 % - 0,5
Agitar y esperar 3 min. sobre baño de hielo
Sulfamato de amonio 0,5% (ml) 0,5 0,5
Esperar 10 minutos, con agitación
Clorhidrato de naftiletilendiamina 0, 1 % (ml) 0,5 0,5
Agitar y observar si aparece color

Interpretación: Una reacción positiva se traduce en la aparición de color rosa violeta, el cual se desarrolla lentamente, más rápidamente si se calienta 5 minutos a 60ºC.

De las benzodiacepinas, solamente el nitrazepan puede ser determinado directamente en orina. No dan esta reacción las siguientes benzodiacepinas: triazolam, alplazolam, ciobazam por tener sustituyentes que no permiten que se forme la benzofenona correspondiente.

Anfetamina:

Ensayo de Baeyer: En un tubo de ensayo se coloca una alícuota del extracto etéreo, se le agrega una o dos gotas de CIH al 1%, luego 5 ml de reactivo diazoico de paranitroanilina, recientemente preparado y a continuación 5 ml de Na2CO3 al 1, 1 %, gota a gota y agitando. Dejar 5 minutos en reposo y agregar de igual forma 1 ml de NaOH al 10%. Dejar 10 minutos.

La reacción positiva se traduce en la aparición de color rosa rojo. Esta reacción la dan las aminas primarias y no las secundarias.

Imipraminas:

Reacción con el reactivo de Forrest: Se colocan unos mililitros del extracto etéreo sobre un vidrio de reloj, se evapora el éter y al residuo se le agrega 1 2 ml del reactívo de Forrest. Reacción positiva corresponde a la aparición de color verde azul. Las fenotiazinas pueden interferir.

Barbitúricos:

Reacción de Parrv Koppanvi: Se coloca una alícuota del extracto sobre un vidrio de reloj, se le agrega 2 3 gotas de solución alcohólica de nitrato de cobalto al 1%, mezclar e incorporarle 1 2 gotas de solución alcohólica de isopropilamina al 5%.

Aparición de color violeta o azul violeta nos indica la presencia de compuestos que poseen la siguiente agrupación CO NH CO , entre los principales derivados tenemos a: barbitúricos, hidantoínas, xantinas, creatinina, narcóticos derivados de la piperidina.

Salicilatos:

Test color: Es una reacción espectrofotométríca, que nos permite cuantificar.

En tres tubos de ensayo rotulados B (blanco) T (testigo) D (desconocido)
HN03 diluido (ml) 3 - -
Estándar 25 mg% (ml) - 0,2 -
Muestra (orina) (ml) - - 0,2
Reactivo color (ml) 3 3 3
Mezclar, dejar en reposo 10 minutos
Leer en espectrofotómetro a 540 nm

Reactivo color: Solución de nitrato férrico diluido en HN03

Cálculo:

Am . Ce
Concentración de Salicílico =
Ae

Am= Absorbancia de la muestra
Ae= Absorbancia del estándar
Ce= Concentración del estándar

 

INVESTIGACION CROMATOGRAFICA:

Luego de ensayar distintos métodos de análisis, se observó que el que presentaba mayor ductilidad y permitía obtener una primera orientación sobre la especie investigada era la metodología de cromatografía en capa fina (TLC).
Por ende y partiendo de esta técnica se procede a realizar un estudio diferencial de los distintos elementos tóxicos que pueden ser identificados mediante el agregado secuencial de distintos reactivos.

Es así que tomando las tres fracciones típicas obtenidas por los métodos de aislamiento de tóxicos orgánicos fijos (éter de petróleo, éter alcalino, éter ácido, cloroformo alcalino) y empleando una sola corrida cromatográfica para cada una de ellas, logramos por el agregado sucesivo de diversos reactivos revelantes combinados y con el empleo de luz ultravioleta, la orientación hacia la identificación de: plaguicidas, barbitúricos, benzodiacepinas, fenotiazinas, hidantoínas, carbamatos, analgésicos antipiréticos, anestésicos, drogas morfeólicas y alcaloides en general.

Debemos dejar aclarado que con esta técnica no pretendemos identificar un compuesto en forma categórica, sino que nos permite acotar el número de tóxicos posibles y luego mediante otras técnicas más sofisticadas identificar el producto con certeza, como por ejemplo empleando: HPLC, CG, CG MASA.

PARTE EXPERIMENTAL:

El proceso analítico que se describe consta de los siguientes pasos.

a) Preparación de las cromatoplacas: se emplea sílicagel G, H ó HP254
b) Elección del solvente de desarrollo: se trata de elegir solventes rápidos, de buena resolución, que nos aseguren una buena diferenciación de los diversos tóxicos.
c) Desarrollo del cromatograma: Las sucesivas placas se desarrollan en cubas rectangulares previamente saturadas con el solvente de corrida y a temperatura ambiente,
d) Elección de reactivos reveladores: En general, son los empleados comúnmente en la práctica toxicológica. Entre ellos y mediante un estudio exhaustivo de sus características cromáticas, se seleccionaron aquellos que permitían su utilización secuencia¡ sin perder sus propiedades específicas y sin interacción entre sí.

Investigación en la fracción éter de petróleo: Esta fracción está destinada a la investigación de la presencia de plaguicidas organoclorados y organofosforados, la cual se puede realizar en forma conjunta.(Su investigación detallada se verá en el seminario de "plaguicidas").

Investigación en la fracción éter ácido: Se realiza la investigación en forma conjunta de drogas ácidas y neutras, entre las cuales podemos citar: Barbitúricos, Hidantoínas, Glutetimidas, Carbamatos, Analgésicos antipiréticos.

Soporte: Silicagel HF con indicador de fluorescencia.

Solvente de desarrollo: Ciclohexano : n-propanol:acetato de etilo:amoníaco (30:40:20:10).
Metanol : amoníaco (100 : 1,5)

Reactivos reveladores.

Reactivo A: Acetato de cobalto al 0,5% en metanol
Reactivo B: Hidróxido de litio al 0,5% en metanol
Ambos reactivos son propuestos por Lundquist, F para la identificación de barbitúricos.
Reactivo C: Solución saturada de Nitrato Mercurioso. Es un buen reactivo diferencial para barbitúricos y carbamatos.
Reactivo D: Solución de Cloruro Férrico al 1%, para salicílico

La técnica desarrollada es la siguiente: una vez sembrada la placa y desarrollado el cromatograma en forma habitual, se procede al revelado secuencial.

En primer lugar, se observa la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm, manifestándose la presencia de barbitúricos, glutetimidas e hidantoínas como manchas de absorción de distinta intensidad. Dichas manchas desaparecen cuando se observan bajo luz ultravioleta a 366 nm.

A continuación se rocía la misma con los reactivos A y B, comprobándose que los barbitúricos, glutetimidas e hidantoínas dan máculas de color fila de distinta intensidad.

Posteriormente, se realiza la aspersión del reactivo C, donde se comprueba que las manchas anteriores se toman blancas sobre fondo gris y aparecen otras no observables hasta ese momento de características similares que corresponden a los carbamatos

También se ven manchas pardas muy poco definidas que corresponden a los analgésicos antipiréticos.

Finalmente se rocía la placa con el reactivo D, apareciendo en esta instancia los analgésicos antipiréticos como máculas violetas.

Revelado secuencial (alternativa):

a) Observación con luz UV: Se hace una observación a 254 nm para localizar drogas con intensa absorbancia. Si a 366 nm desaparecen se presume: barbitúricos, glutetimidas o hidantoínas. Exponiendo a vapores de NH3 se incrementa la absorbancia de los barbitúricos.
De acuerdo a lo anterior caben dos posibilidades:
A: que no se observe ninguna mancha absorbente
B: que se observe mancha absorbente

Caso A: Si esto ocurre se rocía con Rvo, de Van Urk ( p dimetilaminobenzaldehído), se observa a 366 nm. Las benzodiacepinas aparecen con fluorescencia amarilla.
Por último, el revelado con cloruro férrico, permite la aparición de manchas correspondientes a los metabolitos de la aspirina y otros analgésicos antipiréticos tomando distintos colores como: dipirona (azul), fenazona (naranja), amidopirina (violeta).

Caso B: Si se observan manchas absorbentes puede usarse el reactivo de Parry apareciendo manchas de color lila (barbitúricos y la fenilhidantoína)
A continuación se prosigue con nitrato mercurioso, las manchas de los barbitúricos, hidantoínas y glutetimidas se toman blancas sobre fondo gris, también aparecen manchas no observables hasta ese momento correspondientes a los carbamatos y otras poco definidas de los analgésicos antipiréticos.
Finalmente se rocía la placa con cloruro férrico, apareciendo los analgésicos antipiréticos como manchas violetas.

NOTA: Una vez rociado el reactivo revelante y antes de pasar al siguiente conviene colocar la placa en estufa para permitir el secado de la misma.

Investicación de la fracción éter alcalino: Se investiga la presencia de aminas despertadores, benzodiacepinas, fenotiazinas, anestésicos locales, alcaloides, aminas de la putrefacción.

Soporte: Sílicagel G o H.

Solvente de desarrollo: Metanol : amoníaco (100 : 1,5)

Reactivos reveladores

Reactivo A: 2 4 dinitrofluorobenceno al 0,5% en etanol
Reactivo B: Acido clorhídrico al 10%.
Reactivo C: Reactivo de Marquis.
Reactivo D: Naftoquinolsulfonato de sodio en solución al 1%
Reactivo E: Reactivo de Draggendorff
Reactivo F: lodoplatinato de potasio.

Se desarrolla el cromatograma en la forma habitual, se deja secar la placa y se procede a su revelado. Se rocía con el reactivo A, las drogas simpaticomiméticas (aminas despertadoras), se manifiestan como manchas amarillas intensas sobre un fondo amarillo más claro. Para acentuar este efecto se lleva la placa a estufa de 100°C durante 10 minutos, luego se la deja enfriar y se rocía con el reactivo B. Así desaparece el color del fondo y quedando sólo las manchas amarillas de las aminas.

Se efectúa la observación de la placa a la luz ultravioleta, pudiendo diferenciarse la feniletilamina de la anfetamina, ambas reveladas con el reactivo A, con un Rf semejante, la primera fluorece mientras que la segunda absorbe. También se puede apreciar la presencia de benzodiacepinas que por lo general presentan una ligera fluorescencia la cual se intensifica con el agregado del reactivo B.

También este reactivo nos permite observar la presencia de los tranquilizantes fenotiazínicos, apareciendo en la cromatoplaca como manchas naranjas, rojas o violetas.

Luego del agregado de los reactivos A y B y la observación a la luz ultravioleta y visible, se procede a rociar la placa con el reactivo C que pone de manifiesto morfina y sus derivados como máculas de color violeta.

Posteriormente, se trata con el reactivo D que pone de manifiesto los anestésicos arilamínicos primarios que aparecen como manchas de color naranja. Luego se rocía con el reactivo E para poner de manifiesto las drogas benzodiacepínicas y alcaloides. En este punto conviene agregar que de coincidir las manchas fluorescentes al UV con las máculas de color naranja que aparecen por acción del Reactivo de Draggendorff, puede sospecharse con fundamento la presencia de benzodiacepinas.

Finalmente, la placa se rocía con el reactivo F, apareciendo los alcaloides, anestésicos locales, aminas de la putrefacción, con coloraciones que van del violeta, azul marrón, mientras que la feniletilamina y las aminas despertadoras aparecen de color amarillo.

De esta forma logramos en un mínimo de tiempo investigar un amplio espectro toxicológico de la muestra objeto del análisis, permitiendo de esta forma descartar en caso de reacciones negativas una amplia gama de tóxicos comunes y en caso de positividad orientamos hacia la búsqueda de un tóxico en particular.

 

PREPARACION DE REACTIVOS:

Reactivo de Van Urk: Disolver 1 gr de p dimetílaminobenzaldehido en 34 ml de ClH concentrado, diluir cuidadosamente con 16 ml de agua y 50 ml de etanol.

Cloruro férrico: Solución al 5% en agua destilada

Reactivo de Pany: Acetato de cobalto al 5% en metanol

Reactivo 2 4dinitrofluorbenceno: Solución al 0,5% en etanol

Reactivo Naftoquinonsulfonato de sodio: Solución al 1% en agua destilada

Reactivo lodoplatinato de potasio: Disolver 18 gr de KI en 180 ml de agua destilada. Por otro lado disolver 1 gr de ácido cloroplatínico en agua destilada. Se reúnen las dos soluciones y se agrega 400 ml de agua destilada.

Reactivo de Dragendorff: Suspender 5 gr de oxicarbonato de bismuto en 50 ml de agua destilada, luego 10 ml de ClH concentrado y después 25 gr de KI, llevar todo a 100 ml con agua destilada.

Reactivo FPN (cloruro férrico, ác. perclórico, ác. nítrico):

N03H: hacer una dilución 1:2 de NO3H concentrado
Cl04H: 20 ml de Cl04H 70% en 50 ml de agua, dejar enfriar y llevar a 100 ml
Cl3Fe: disolver 5 gr de Cl3Fe en 50 ml de agua destilada, llevar a 100ml
Mezclar éstas soluciones en las siguientes proporciones. una parte de la solución de Cl3Fe, nueve partes de la solución de Cl04H y diez partes de la solución de N03H. Conservar en frasco color caramelo.

Reactivo de Forrest:

N03H: ver preparación del rvo. FPN
Cl04H: ver preparación del rvo. FPN
S04H2 12N: agregar lentamente 30 ml de S04H2 concentrado a 50 ml de agua destilada. Enfriar y diluir a 100 ml
Cr07K2: agregar 200 mg de Cr07K2 a 80 ml de agua destilada, disolver y llevar a 100 ml

Mezclar 100 ml de cada uno de los reactivos anteriormente citados. Conservar en frasco color caramelo.

Solución de p-nitroanilina diazotada.

Solución A: N02Na al 0,7 %
Solución B: p-nitroanilina 0,6 gr en 3 ml de ClH concentrado, dejar reposar 10 minutos y agregar 97 ml de agua destilada, filtrar.
Diazotación: Mezclar 50 ml de la solución B más 10 ml de ClH concentrado, dejar 10 minutos en baño de hielo y agregar 30 ml de la solución A. Mezclar 5 minutos en baño de hielo. Usar inmediatamente.